Сиртуины

Сиртуины (sirtuins, Silent Information Regulator 2 (Sir2) proteins)- класс белков, обладающих свойствами гистоновой деацетилазы и монорибозилтрансферазы. Обнаружены во всех организмах- от бактерий до человека.
Дрожжевой Sir2 и некоторые, но не все, сиртуины являются деацетилазами. В отличие от других белковых деацетилаз, которые просто гидролизуют ацетил- лизиновые остатки, сиртуин- опосредованое деацетилирование сочетает в себе деацетилирование остатков лизина и гидролиз НАД.

В результате гидролиза образуются О-ацетил-АДФ-рибоза, деацетилированный субстрат и никотинамид, который является ингибитором активности сиртуинов. Поэтому активность сиртуинов зависит от энергетического состояния клетки через НАД, его отношение к НАДН, уровня НАД, НАДН и никотинамида, либо через сочетание этих параметров.

Сиртуины регулируют процессы старения, транскрипции, апоптоза и сопротивляемость стрессу. Регуляция метаболизма и клеточные защитные механизмы, в которых участвуют сиртуины, могут быть использованы для увеличения продолжительности жизни.

Исследователи Гарвардского университета выявили серию молекулярных превращений, которые приводят к старению всех без исключения эукариот.

Ядра эукариот содержат хроматин, который отсутствует у прокариот. Хроматин образован нуклеиновыми кислотами и белками. Среди последних особая роль принадлежит протеинам из группы гистонов. Из них построены нуклеосомы, опорные структуры, на которые намотаны нити ДНК.

Гистоны принимают непосредственное участие в считывании генетической информации, иначе говоря, ее перезаписи с молекул ДНК на молекулы РНК. При плотной упаковке гистонов такая перезапись не происходит, и гены пребывают в пассивном состоянии.  Чтобы тот или иной ген начал работать, связанные с ним гистоны должны несколько разрыхлиться.

В этих процессах участвуют различные ферменты, от работы которых зависит плотность гистонной упаковки. К их числу относятся ферменты из группы сиртуинов. Они вынуждают гистоны переходить в состояние с более плотной упаковкой и тем самым затрудняют включение генов.

Как мы говорили выше, сиртуины работают в клетках великого множества эукариот – от одноклеточных организмов до млекопитающих. Около 10 лет назад Дэвид Синклер (David Sinclair) и его коллеги из Массачусетского технологического института обнаружили, что гиперэкспрессия сиртуина, который кодируется геном Sir2, замедляет старение дрожжевых клеток. Точнее, они обнаружили, что его избыток увеличивает число делений, которые клетки могут претерпевать в течение своей жизни. Дальнейшие исследования показали, что этот фермент не только меняет плотность гистонной упаковки и тем регулирует активность генов, но и участвует в ремонте повреждений ДНК.

Открытие этого эффекта вызвало большой интерес в научной среде и в средствах массой информации. Однако ученые долгое время не знали, действуют ли сиртуины в таком же качестве и в клетках высших эукариот, прежде всего млекопитающих.

Теперь на этот вопрос найден ответ, причем положительный. Он содержится в статье того же Синклера (он сейчас занимает кафедру в Гарвардском университете), его сотрудника Филиппа Обердорффера (Philipp Oberdoerffer) и их соавторов, которая появилась в журнале Cell (статья). Они изучили, как зависит здоровье клеток мышей от активности гена SIRT1. Этот ген у млекопитающих отвечает за производство фермента, аналогичного дрожжевому белку, который кодирует ген Sir2.

Оказалось, что функции обоих ферментов очень схожи друг с другом. Это и позволяет утверждать (или, как минимум, предполагать), что сиртуины задействованы в очень древнем механизме клеточного старения, который биологическая эволюция изобрела свыше миллиарда лет назад.

В основе этого механизма лежит постепенное ослабление способности сиртуинов одновременно выполнять обе свои главные функции. Как уже говорилось, эти ферменты уплотняют гистонные каркасы нуклеосом и тем самым предотвращают включение тех генов, продукты которых в данный момент клетке не нужны или даже вредны. Однако сиртуины в то же время помогают устранять поломки ДНК, вызванные ультрафиолетовым излучением или свободными радикалами. При появлении таких дефектов молекулы этих белков срочно мигрируют из мест первоначального расположения в горячие точки. Такая миграция на время ослабляет сиртуиновый контроль за гистонными структурами и потому увеличивает вероятность нештатного включения различных генов.

Как показали эксперименты исследователей группы Синклера, степень этой вероятности зависит от возраста. У молодых животных поломки ДНК возникают не так уж часто, поэтому сиртуины-ремонтники обычно успевают вовремя вернуться к месту службы. Однако с возрастом клетки начинают производить больше свободных радикалов (в основном, из-за прогрессирующего износа органов внутриклеточного дыхания, митохондрий). Из-за этого сиртуины покидают места постоянной дислокации чаще и на более длительное время, а потому хуже следят за плотностью гистонов. Последствия понятны: клетки пожилых особей начинают все чаще страдать от активации ненужных генов. Такое разбалансирование генного аппарата как раз и приводит к старению организма.

В заключение стоит напомнить, что активность гена SIRT1 можно увеличить с помощью некоторых пищевых продуктов и специальных препаратов. Эту задачу выполняет сильный антиоксидант ресвератрол, который входит в состав красного винограда и красных вин. Выполненные в разных странах опыты показали, что прием ресвератрола продлевает жизнь разных позвоночных – от рыб до млекопитающих.

В настоящее время на животных успешно испытывают синтетические соединения, которые активируют SIRT1 в сотни раз сильнее ресвератрола. Хотелось бы надеяться, что такие вещества могут замедлять процессы старения и у людей.

(Портал «Вечная молодость» www.vechnayamolodost.ru)

Полный обзор Синклера по данной теме:

СЕКРЕТ ГЕНОВ ДОЛГОЛЕТИЯ

Ученые университета Южной Калифорнии, работающие под руководством доктора Вальтера Лонго (Valter Longo), утверждают, что в некоторых случаях гиперэкспрессия белков семейства сиртуинов, известных благодаря способности замедлять старение, вызывает окислительные повреждения клеток мозга.

Существуют свидетельства участия белков Sir2 в продлевающих жизнь механизмах (о чем мы говорили выше), ассоциированных с ограничением калорийности рациона у ряда организмов (но не у всех). Кроме того, авторы продемонстрировали, что отсутствие сиртуинов в клетках дрожжей еще больше продлевает жизнь «голодающим» клеткам.

SirT1 – вариант Sir2, содержащийся в клетках млекопитающих, – участвует в управлении множеством физиологических процессов, в том числе метаболизмом глюкозы, восстановлением повреждений ДНК и клеточной гибелью. Он также регулирует активность ряда факторов, участвующих в формировании стресс-реакций.

Согласно результатам работы группы Лонго, нейроны крыс в клеточной культуре гораздо чаще выживают при воздействии соединений, индуцирующих окислительный стресс, если в питательную среду добавить ингибитор SirT1 (статья).

В мозге живых генетически модифицированных мышей с нокаутированным геном SirT1 уровень окислительного стресса оказался более низким, чем у мышей с нормальным синтезом этого белка. Но продолжительность жизни мышей, не имеющих гена SirT1, была меньше, чем у обычных, независимо от калорийности рациона.

Полученные результаты свидетельствующие о том, что SirT1, как и его аналог Sir2 в клетках дрожжей, обладает проокислительной функцией. Однако они подтверждают, что сиртуины выполняют как положительную, так и отрицательную роли. Опираясь на полученные данные, Лонго предупреждает, что разработка стимулирующих активность SirT1 препаратов для клинического использования еще очень преждевременна, т.к. необходимо еще получить убедительные доказательства безопасности их длительного приема.

(Портал "Вечный разум" www.eternalmind.ru)

Прочитать по теме:
Статья Вальтера Лонго "Сиртуины, ИФР1 и голодание"

Как же сиртуины осуществляют свои регуляторные функции? Исследователи из Division of Endocrinology, Gerontology, and Metabolism, Stanford University School of Medicine под руководством Katrin Chua опубликовали работу по связи сиртуинов и транскрипционного фактора NF-kappaB (статья).
NF-kappaB (NF-kB)- универсальный фактор транскрипции, контролирующий экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла. Нарушение регуляции NF-kB вызывает воспаление, аутоиммунные заболевания, а также развитие вирусных инфекций и рака. Семейство NF-kB состоит из 5 белков: NF-kB1 (или p50), NF-kB2 (или p52), RELA (или p65), RelB и c-Rel,
образующих 15 комбинаций димеров. Все белки семейства объединяет
наличие домена гомологии REL, который обеспечивает образование белковых димеров, связывание NF-kB с ДНК и с цитозольным ингибиторным белком IkB. Фактор NF-kB проявляет активность только в димерной форме, причём наиболее распространённые формы — димер субъединиц p50 или p52 с субъединицей p65.
NF-kB активируется целым рядом стимулов, включая цитокины (такие как TNF и интерлейкин 1), T- и B-клеточные митогены, бактериальные и вирусные продукты (все лиганды толл-подобных рецепторов, например липополисахарид или двухцепочечная вирусная РНК) и факторы стресса (такие как активные формы кислорода или ультрафиолет).
В цитоплазме клетки NF-kB находится в неактивном состоянии в комплексе с ингибиторным белком IkB. Стимулирующий агент приводит к тому, что IkB фосфорилируется под действием киназы IKK (IkB-киназа), что приводит к деградации IkB в результате действия протеосомы 26S. При этом NF-kB высвобождается от ингибирующего комплекса, транслоцируется в ядро и активирует транскрипцию контролируемых генов.

Ученые из Стенфордского университета пришли к выводу, что один из членов семейства сиртуинов- SIRT6- действует через ослабление сгнального пути NF-kB. SIRT6 взаимодействует с субъединицей NF-kB RELA и деацетилирует лизин 9 гистона H3 (H3K9) на промоторах генов- мишеней NF-kB. В клетках с недостатком SIRT6 гиперацетилирование H3K9 на этих промоторах приводит к усилению связывания RELA с промотором, усилению NF-kB- зависимой модуляции экспрессии генов, апоптозу и клеточному старению. Анализ генома показал увеличение активности NF-kB-регулируемой экспрессии генов в различных SIRT6- дефицитных тканях in vivo. Кроме того, недостаток RELA у мышей с дефицитом SIRT6 может предотвращать раннюю летальность и развитие дегенеративных синдромов.
Вывод: SIRT6 ослабляет действие NF-kB через деацетилирование H3K9. Гиперактивация NF-kB приводит к преждевременному и нормальному старению.

Белок SIR-2.1 C. elegans задействован в процессе старения, его аналог у млекопитающих SIRT1, как уже говорилось выше, участвует в различных клеточных процессах, в том числе репрессии транскрипции и ответе на стресс. Ученые из Wellcome Trust Centre for Gene Regulation and Expression, University of Dundee под руководством Anton Gartner доказали, что SIR-2.1 необходим для запуска апоптоза в ответ на повреждение ДНК, а кроме того SIR-2.1 работает параллельно p53- подобному гену cep-1 (статья). Этот cep-1- независимый проапоптотический путь не требует транскрипционного фактора daf-16 FOXO. Цитологический анализ SIR-2.1 свидетельствует о новом механизме индукции апоптоза. В процессе апоптоза SIR-2.1 меняет свою субклеточную локализацию с ядра на цитоплазму и временно локализуется на периферии ядра с гомологом белка Apaf-1 у нематод-белком CED-4. Транслокация SIR-2.1- раннее событие апоптоза эмбриональных клеток, происходит независимо от запуска апоптоза и cep-1. Возможно, транслокация SIR-2.1 связана с индукцией апоптоза, связанного с повреждением ДНК.

Как мы только что отметили, локализация сиртуинов имеет значение для их функционирования, они могут локализоваться не только в ядре и цитоплазме, но и в митохондриях. Сиртуины участвуют в регуляции функционирования митохондрий. В митохондриях содержатся Sirt3, Sirt4 и Sirt5. Для Sirt3 известна одна мишень, так же, как и для Sirt4, в то время как для Sirt5 мишени неизвестны. В Laboratory of Biochemistry, Department of Physiological Chemistry Ruhr-University Bochum идентифицировали мишени для Sirt3 и Sirt5 (статья). Ученые показали, что Sirt3 деацетилирует и тем самым активирует центральный регулятор метаболизма в митохондриальном матриксе - глутаматдегидрогеназу. Кроме того Sirt3 деацетилирует и активирует изоцитратдегидрогеназу 2, фермент, который обеспечивает регенерацию антиоксидантов и катализирует ключевые реакции цитратного цикла.
Обнаружено, что N- и C- концы Sirt3 регулируют его активность в отношении глутаматдегидрогеназы и пептидного субстрата, что свидетельствует о роли этих областей в распозновании субстрата и регуляции сиртуинов.
Sirt5, в отличие от Sirt3, не деацетилирует белки матрикса митохондрий. Он деацетилирует цитохром C- белок межмембранного пространства митохондрий, занимающий центральное место в метаболизме кислорода, а также в инициации апоптоза. Sirt5 может быть перемещен в митохондриальное межмембранное пространство и в матрикс, что свидетельствует о том, что локализация важна для регуляции Sirt5 и выбора субстрата.

Как мы говорили выше, сиртуины вовлечены во множество важнейших клеточных процессов- генетический контроль, старение, выживание клеток, метаболизм и репарацию ДНК. У дрожжей Sir2 обеспечивает транскрипционное "молчание" хроматина, подавляет рекомбинацию между повторами, подавляет клеточное старение. Но как же регулируется функционирование сиртуинов? Исследователи из лаборатории под руководством Hiten Madhani, Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco, провели работу по поиску в геноме дрожжей Saccharomyces cerevisiae негативных регуляторов активности сиртуинов в репортерном гене, находящемся сразу за "молчащей" областью (статья). В ходе проведенного анализа было идентифицировано 40 областей, 20 из которых ранее не связывали с регуляцией сиртуинов. В добавок к хроматин-ассоциированным факторам, препятствующим внешнему сайленсингу (Bdf1, SAS-I complex, Rpd3L complex, Ku), ученые идентифицировали в качестве анти-сайленсингового фактора Rtt109 (ацетилтрансферазу лизина 56 гистона H3, связанную с репарацией ДНК). Эти результаты свидетельствуют о том, что Rtt109 действует независимо от своих предположительных эффекторов- Rtt101 куллина, Mms1, Mms22, и демонстрирует неожиданное взаимодействие между ацетилированием H3K56 (лизина 56 гистона H3) и H4K16 (лизина 16 гистона H4). В ходе исследования также были идентифицированы субъединицы медиатора (Soh1, Srb2, and Srb5) и факторы метаболизма мРНК (Kem1, Ssd1), что может свидетельствовать о том, что слабый сайленсинг осуществляется через влияние на структуру мРНК. Также были идентифицированы некоторые метаболические факторы- PAS-киназа Psk2, митохондриальный гомоцистеиновый детоксикационный фермент Lap3, матураза Isa2. Предполагается, что PAS- киназа интегрирует метаболические сигналы для контроля активности сиртуинов.

Рассмотрим примеры участия сиртуинов в развитии возраст- ассоциированных заболеваний, таких как рак простаты. Рак простаты- самое часто встречающееся возраст-ассоциированное онкологическое заболевание. С возрастом вероятность его развития значительно увеличивается. Поэтому необходимо определить связь механизмов старения и развитие рака простаты. Исследованием этой проблемы занимаются в Department of Dermatology University of Wisconsin ученые под руководством профессора Nihal Ahmad. Они предположили, что Sirt1 гиперэкспрессируется в клетках рака простаты, и его ингибирование обладает анти-пролиферативным эффектом на клетки рака простаты (статья). Получены данные о том, что Sirt1 в раковых клетках экспрессируется значительно сильнее, чем в нормальных эпителиальных клетках простаты, об этом свидетельствует уровень белка, мРНК и ферментативная активность сиртуина. Кроме того, в раковых клетках сиртуин экспрессируется сильнее, чем в окружающих простату нормальных тканях. Ингибирование Sirt1 через никотинамид и сиртинол (на уровне активности) или с помощью коротких РНК, образующих шпильки (shRNA) (на генетическом уровне) приводит к значительному снижению роста и жизнеспособности человеческих клеток рака простаты, в то время как на нормальных клетках такого эффекта не наблюдалось. Было обнаружено, что ингибирование Sirt1 приводит к усилению ацетилирования и транскрипционной активности FoxO1 в клетках рака простаты. Ученые пришли к выводу Sirt1 способствует развитию рака простаты через ингибирование активации FoxO1. Поэтому Sirt1 может стать мишенью для терапевтического воздействия при раке простаты.

Старение проявляется не только в виде страшных тяжелых заболеваний- рака, атеросклероза, диабета и других, но и в виде старения кожи, что в большей степени связано с эстетическими аспектами старения. SIRT1 деацетилирует различные мишени, участвуя в клеточных сигнальных путях, ответе на стресс, апоптоз и дегенерация аксонов. Роль SIRT1 в ответе на ультрафиолетовое облучение пока неизвестна. Ученые из Department of Biology, Providence College под руководством Yinsheng Wan обнаружили экспрессию SIRT1 в культуре человеческих кератиноцитов (статья).
Воздействие ультрафиолета и перекиси водорода на кожу подавляет SIRT1. В этот процесс вовлечена АФК- зависимая активация JNK. Активатор SIRT1, антиоксидант ресвератрол, защищает от клеточной смерти, индуцированной ультрафиолетом и перекисью водорода, в то время как ингибиторы сиртуинов, сиртинол и никотинамид усиливают гибель клеток. Активация SIRT1 отрицательно регулирует УФ- и перекись- индуцированное ацетилирование p53, никотинамид, сиртинол и siRNA усиливают ацетилирование p53, ресвератрол это ацетилирование подавляет. SIRT1 участвует в УФ-индуцированном фосфорилировании AMPK, ацетил-КоА и киназы PFK-2. Эти данные улучшают понимание механизмов УФ-зависимого старения кожи и свидетельствуют о том, что активаторы SIRT1, такие как ресвератрол, могут применяться в качестве средств анти-старения для кожи.

Сиртуины- белки, имеющие важнейшее значение в клетке, регулирующие главные клеточные процессы. Но действие их неоднозначно. В связи с этим возникают вопросы:
1) Чего больше в действии сиртуинов- положительного или отрицательного?
2) Как можно использовать сиртуины для борьбы со старением?
3) Насколько это будет эффективно и безопасно?
4) На что действуют сиртуины?
5) Как можно регулировать их активность?
6) Каковы перспективы использования регуляторов активности сиртуинов для лечения различных заболеваний?
и мн. др.

11 января 2009 года