Малые интерферирующие РНК

Длина siRNA 21-25 п.н., они образуются из дцРНК. Источником таких РНК могут быть вирусные инфекции, введенные в геном генетические конструкции, длинные шпильки в составе транскриптов и двунаправленная транскрипция мобильных элементов.
дцРНК нарезаются РНКазой Dicer на фрагменты длиной 21-25 п.н. с выступающими на 2 нуклеотида 3'-концами, после чего одна из цепей входит в состав RISC и направляет разрезание гомологичных РНК. В составе RISC присутствуют siRNA, соответствующие как плюс-, так и минус- цепям дцРНК. siRNA не имеют собственных генов и представляют собой фрагменты более длинных РНК. siRNA направляют разрезание РНК-мишени, поскольку полностью ей комплементарны. У растений, грибов и нематод в процесс подавления экспрессии генов вовлечены РНК-зависимые РНК-полимеразы, для которой siRNA служат еще и праймерами (затравками для синтеза новой РНК). Образовавшаяся дцРНК нарезается Dicer, образуются новые siRNA, которые являются вторичными. Таким образом происходит амплификация сигнала.

В 1998 году Craig C. Mello и Andrew Fire опубликовали статью в Nature, в которой говорилось, что двуцепочечные РНК (дцРНК) способны подавлять экспрессию генов. Позже выяснилось, что действующее начало в этом процессе- короткие одноцепочечные РНК. Механизм подавления экспрессии генов с помощью этих РНК назван
РНК-интерференцией, а также РНК-сайленсингом. Такой механизм обнаружен у всех крупных таксонов эукариот: позвоночных и беспозвоночных животных, растений и грибов. В 2006 году за это открытие получена Нобелевская премия.
Подавление экспрессии может происходить на уровне транскрипции или посттранскрипционно. Оказалось, что во всех случаях необходим сходный набор белков и короткие (21-32 п.н.) РНК.
siRNA регулируют активность генов двумя способами. Как говорилось выше, они направляют разрезание РНК-мишеней. Это явление получило название "подавление" (quelling) у грибов, "посттрансляционный сайленсинг генов" у растений и "РНК-интерференция" у животных. в этих процессах участвуют siRNA длиной 21-23 п.н. Другой тип воздействия- siRNA способны подавлять транскрипцию генов, содержащих гомологичные siRNA-последовательности. Это явление было названо транскрипционным сайленсингом генов(TGS) и обнаружено у дрожжей, растений и животных. siRNA направляют модификации гистонов и метилирование ДНК, что приводит к образованию гетерохроматина и репрессии транскрипции. Лучше всего TGS изучен у дрожжей S.pombe , обнаружено, что у них siRNA встраиваются в похожий на RISC белковый комплекс, названный RITS. В его случае,как и в случае RISC, siRNA взаимодействует с белком семейства AGO. Вероятно, siRNA способна направлять этот комплекс к гену, который содержит гомологичный siRNA фрагмент. После этого белки RITS рекрутируют метилтрансферазы, в результате чего в локусе, кодирующем ген-мишень siRNA, формируется гетерохроматин, и активная экспрессия гена прекращается.

Рассмотрим вышеописанную схему РНК-интерференции в динамике

Каково же значение siRNA в клетке?
siRNA вовлечены в защиту клетки от вирусов, репрессию трансгенов, регуляцию некоторых генов и формирование центромерного гетерохроматина. Важная функция siRNA-подавление экспрессии мобильных генетических элементов. Такое подавление может происходить как на уровне транскрипции, так и посттранскрипционно.
Геном некоторых из вирусов состоит из ДНК, у некоторых же - из РНК, причем, РНК у вирусов может быть как одно-, так и двуцепочечной. Сам процесс разрезания чужеродной (вирусной) мРНК в этом случае происходит так же, как было описано выше, то есть путем активации комплекса ферментов RISC. Однако для большей эффективности растения и насекомые изобрели своеобразный путь усиления защитного действия siRNA. Присоединяясь к цепи мРНК, участок siRNA может с помощью комплекса ферментов DICER  сначала достроить вторую цепочку мРНК, а затем разрезать ее в разных местах, создавая таким образом разнообразные "вторичные" siRNA. Они, в свою очередь, формируют RISC и проводят мРНК через все стадии, о которых шла речь выше, вплоть до ее полного уничтожения. Такие "вторичные" молекулы смогут специфично связываться не только с тем участком вирусной мРНК, к которому была направлена "первичная" молекула, но также и с другими участками, что резко усиливает эффективность клеточной защиты.

Таким образом, у растений и низших животных организмов siRNA являются важным звеном своеобразного "внутриклеточного иммунитета ", позволяющего распознавать и быстро уничтожать чужую РНК. В том случае, если в клетку проник РНК - содержащий вирус, такая система защиты не даст ему размножиться. Если же вирус содержит ДНК, система siRNA будет мешать ему производить вирусные белки (так как необходимая для этого мРНК будет распознаваться и разрезаться), и с помощью этой стратегии замедлит его распространение по организму.

У млекопитающих же, в отличие от насекомых и растений, работает и другая система защиты. При попадании в "зрелую" (дифференцированную) клетку млекопитающего чужой РНК, длина которой больше 30 п.н., клетка начинает синтез интерферона. Интерферон, связываясь со специфическими рецепторами на клеточной поверхности, способен стимулировать в клетке целую группу генов. В результате в клетке синтезируется несколько видов ферментов, которые тормозят синтез белков и расщепляют вирусные РНК. Кроме того, интерферон может действовать и на соседние, еще не зараженные клетки, блокируя тем самым возможное распространение вируса.

Как можно заметить, обе системы во многом схожи: у них общая цель и "методы" работы. Даже сами названия "interferon" и "(RNA) interference" происходят от общего корня. Но есть у них и одно очень существенное различие: если интерферон при первых признаках вторжения просто "замораживает" работу клетки, не позволяя (на всякий случай) производство многих, в том числе и "невиновных" белков в клетке, то система siRNA отличается чрезвычайной разборчивостью: каждая siRNA будет распознавать и уничтожать только свою, специфическую мРНК. Замена всего лишь одного нуклеотида внутри siRNA ведет к резкому снижению эффекта интерференции. Ни один из блокаторов генов, известных до сих пор, не обладает такой исключительной специфичностью по отношению к своему гену-мишени.

Открытие РНК-интерференции дало новую надежду в борьбе со СПИДом и онкологическими заболеваниями. Возможно, применяя терапию siRNA вместе с традиционной антивирусной терапией, можно достичь эффекта потенцирования, когда два воздействия приводят к более выраженному лечебному эффекту, чем простая сумма каждого из них, применяемого по отдельности.
Для того, чтобы использовать механизм siRNA - интерференции в клетках млекопитающих, внутрь клеток нужно ввести уже готовые двухцепочечные молекулы siRNA. Оптимальный размер таких синтетических siRNA при этом составляет те же 21-28 нуклеотидов. Если увеличить ее длину - клетки ответят выработкой интерферона и снижением синтеза белка. Синтетические siRNA могут попасть как в зараженные, так и в здоровые клетки, и снижение выработки белков в незараженных клетках будет крайне нежелательным. С другой стороны, если попытаться применять siRNA меньшие, чем 21 нуклеотид, резко снижается специфичность ее связывания с нужной мРНК и способность к формированию комплекса RISC.

Если удастся тем или иным способом доставить siRNA, обладающую способностью связываться с каким-либо участком генома ВИЧ (который, как известно, состоит из РНК), можно попытаться не допустить его встраивания в ДНК клетки хозяина. Кроме того, ученые разрабатывают пути воздействия на различные этапы размножения ВИЧ в уже зараженной клетке. Последний подход не обеспечит излечение, однако может существенно уменьшить скорость размножения вируса и дать загнанной в угол иммунной системе шанс "отдохнуть" от вирусной атаки, и самой попытаться расправиться с остатками заболевания. На рисунке  те два этапа размножения ВИЧ в клетке, которые, как надеются ученые, можно заблокировать с помощью siRNA, отмечены красными крестами (этапы 4-5 - встраивания вируса в хромосому, и этапы 5-6 - сборка вируса и выход из клетки).

На сегодняшний день, правда, все вышесказанное относится лишь к области теории. На практике терапия siRNA встречается с затруднениями, обойти которые ученым пока не удается. Например, в случае антивирусной терапии именно высокая специфичность siRNA может сыграть злую шутку: как известно, вирусы обладают способностью быстро мутировать, т.е. изменять состав своих нуклеотидов. Особенно преуспел в этом ВИЧ, частота изменений которого такова, что у человека, заразившегося одним подтипом вируса, через несколько лет может быть выделен абсолютно непохожий на него подтип. В этом случае измененный штамм ВИЧ автоматически станет нечувствительным к siRNA, подобранной в начале терапии.

Как и любой эпигенетический фактор, siRNA влияют на экспрессию генов, которые заставляет "молчать". Сейчас появляются работы, в которых описаны эксперименты по выключению генов, ассоциированных с опухолями. Гены выключают (knock-down) именно с помощью siRNA. Например, китайские ученые с помощью siRNA выключали ген транскрипционного фактора 4 (TCF4), активность которого служит причиной синдрома Pitt-Hopkins (очень редкое генетическое заболевание, характеризующееся умственной отсталостью и эпизодами гипервентиляции и апноэ) и других умственных заболеваний. В данной работе проводилось изучение роли TCF4 в клетках рака желудка. Эктопическая экспрессия TCF4 снижает рост клеток в линиях клеток рака желудка, выключение гена TCF4 с помощью siRNA повышает миграцию клеток. Таким образом, можно сделать вывод, что эпигенетическое выключение (сайленсинг) гена TCF4 играет важную роль в образовании и развитии опухоли.

Согласно исследованиям в Department of Oncology, Albert Einstein Cancer Center под руководством Leonard H. Augenlicht siRNA участвует в выключении гена HDAC4, что вызывает ингибирование роста раковой опухоли толстой кишки, апоптоз и повышение транскрипции p21. HDAC4- это гистоновая деацетилаза, которая является тканеспецифичной, подавляет дифференцировку клеток и ее экспрессия подавлена в течение процесса дифференцировки клеток. В работе показано, что HDAC4 является важным регулятором пролиферации клеток толстой кишки (что имеет значение при раковом процессе), а ее в свою очередь регулируют siRNA.

В Department of Pathology, Nara Medical University School of Medicine в Японии проводились исследования рака простаты. Репликативное старение клеток- это барьер против неконтролируемого деления и канцерогенеза. Короткоживущие делящиеся клетки (TAC) являются частью популяции клеток простаты, из которой и образуется опухоль. Японские ученые изучали причины, по которым эти клетки преодолевают старение. В клетки простаты в культуре были трасфецированы junB siRNA. В этих клетках наблюдается повышенный уровень экспрессии p53, p21, p16 и pRb, выявляемый при старении. Клетки в культуре, которые показали пониженный уровень p16, использовались для следующего этапа. Повторная трансфекция siRNA в TAC позволила клеткам избежать старения при инактивации p16/pRb. Кроме того сайленсинг прото-онкогена junB с помощью junB siRNA вызывает инвазию клеток. На основании этого был сделан вывод, что junB является энхансерным элементом для p16 и способствует клеточному старению, препятствующему малигнизации (озлокачествлению)TAC. Таким образом, junB является регулятором канцерогенеза в простате и может быть целью для терапевтического воздействия. А регулировать его активность можно с помощью siRNA.

Подобных исследований проводится огромное множество. В настоящее время siRNA- это не только объект, но и инструмент в руках исследователя- врача, биолога, онколога, геронтолога. Исследование связи siRNA с онкологическими заболеваниями, с экспрессией возраст-ассоциированных генов- это важнейшая задача для науки. Прошло совсем немного времени с момента открытия siRNA, а сколько появилось интересных исследований и публикаций, связанных с ними. Можно не сомневаться, что их изучение станет одним из шагов человечества к победе над раком и старением...

29 сентября 2008 года