Некодирующие регуляторные генетические элементы

Геном животных и человека- сложнейшая система с многоуровневой системой регуляции. Важную роль в процессах регуляции играют некодирующие последовательности- энхансеры, сайленсеры, инсуляторы.

Активность этих последовательностей определяет уровень транскрипции генов, а следовательно и уровень синтезируемого с них белка. Транскрипция регулируется с помощью промотора, на котором собираются белки транскрипционного комплекса, и энхансера, который с помощью регуляторных белков усиливают транскрипцию генов. Энхансеры высших эукариот способны активировать гены на больших расстояниях (до десятков тысяч пар нуклеотидов). Они действуют вне зависимости от положения относительно направления транскрипции. Существует несколько моделей функционирования энхансеров, большинство из них заключается в том, что белки, связанные с энхансером, непосредственно взаимодействуют с белками, собранными на промоторе, а ДНК между ними выпетливается. Энхансеры практически не обладают специфичностью действия, поэтому в геноме есть другие регуляторы, которые определяют активность и специфичность энхансеров.


Транскрипцию нужно не только активировать, но и подавлять. Для этого существуют сайленсеры. Сайленсеры репрессируют активность генов, они действуют вне зависимости от их положения относительно направления транскрипции и не обладают специфичностью действия.
Предполагается, что специфичность действия энхансеров и сайленсеров определяется инсуляторами, которые блокируют активность энхансера/сайленсера, но это происходит в том случае, если инсулятор находится между промотором и энхансером/инсулятором. При этом инсуляторы не влияют непосредственно на активность энхансера/сайленсера и промотора- энхансер/сайленсер может влиять на незаблокированный инсулятором промотор, а промотор может быть активирован/репрессирован другим энхансером/сайленсером.
В настоящее время предложено много моделей, но детали функционирования неизвестны.

Согласно ныне уже классической книге  Альбертса и др. "Молекулярная биология клетки" существуют две модели действия энхансера в эукариотических клетках, основанные на образовании петли ДНК, наблюдаемой у бактерий. В данном примере энхансер расположен перед кодирующей последовательностью, однако петля может образоваться и если энхансер расположен позади кодирующей последовательности.

Один из предполагаемых механизмов действия энхансера основан на результатах изучения бактериальных систем. Известно, что в клетках бактерий началу транскрипции способствует образование петли ДНК. Это согласуется с данными о том, что энхансеры обычно наиболее эффективны, когда они находятся вблизи промотора; с увеличением расстояния их активность постепенно падает. На рисунке приведена схема двух вариантов действия энхансера с образованием петли:

Предложены и другие гипотезы о механизме действия этого регуляторного элемента:
1. Энхансер может действовать на большом расстоянии, активируя ДНК-топоизомеразу, которая вносит торсионное напряжение в большую петлю ДНК, используя для этого энергию гидролиза АТР.
2. Энхансер может влиять на транскрипцию, действуя как сайт посадки мобильных белков, которые связываются с ДНК и затем движутся вдоль ее молекулы.
3. Энхансер может связывать белки, которые способствуют присоединению близлежащего гена к определенной области ядра, где локализованы факторы транскрипции.
Некоторые сайты ДНК оказывают значительное воздействие на транскрипцию, будучи удаленными от промотора на расстояние 50000 и более нуклеотидных пар. Механизм действия таких сайтов, вероятно, отличается от механизма функционирования энхансеров.
У многих эукариотических генов, кодирующих белки и транскрибируемых РНК-полимеразой II, непосредственно перед сайтом инициации транскрипции находится последовательность, называемая «ТАТА-бокс». Перед инициацией синтеза РНК необходимо, чтобы фактор, играющий важную роль в транскрипции (ТАТА-фактор, TFIID), образовал стабильный транскрипционный комплекс. Последовательности, примыкающие к ТАТА-боксу, формируют нужный для транскрипции элемент (элемент, расположенный перед промотором). И энхансер, и предпромоторный элемент содержат серию коротких нуклеотидных последовательностей, связывающихся с соответствующими регуляторными белками. Эти белки взаимодействуют друг с другом; в результате этого взаимодействия происходит включение или выключение генов. С помощью методов генной инженерии показано, что регуляторные белки часто состоят из нескольких доменов, каждый из которых обладает своей функцией.

И сейчас так же популярна "петлевая модель" транскрипционного комплекса:

Активаторы (Activators)- белки, которые связываются с энхансерами, которые помогают РНК-полимеразе правильно начать транскрипцию.
Репрессоры (Repressor)- белки,которые связывают активаторы, чем снижают или прекращают транскрипцию.
Основные факторы (Basal factors)- белки, которые ориентируют РНК-полимеразу на начало структурной части гена.
TATA box (или Pribnow box)- часть промотора, являющаяся сайтом связывания для белковых факторов.
Транскрипционные факторы (Transcription factors)- помогают занять правильную позицию активаторам и РНК- полимеразе.

Вспомним схему регуляции активности гена, приведенную выше:

Ингибирование транскрипции с использованием регуляторных элементов, называемых сайленсерами, - активный процесс. В этом случае происходит прямое подавление инициации транскрипции путем разрушения транскрипционного комплекса на промоторе или посредством его инактивации иным способом. Первый из описанных в 1986 г. сайленсеров обладал классическими энхансероподобными свойствами, действуя на промоторы, расположенные в цис-положении (на той же молекуле ДНК) на большом расстоянии. При этом активность сайленсера, подобно энхансеру, не зависела от его ориентации по отношению к регулируемому промотору. Активность других сайленсеров зависит от положения их по отношению к регулируемому промотору и ориентации относительно него, и прямо пропорциональна числу их копий. Регуляторные белки, связывающиеся с сайленсерами, по аналогии с белками энхансеров , помимо ДНК-связывающих доменов содержат аминокислотные последовательности, обеспечивающие белок-белковые взаимодействия, которые необходимы для осуществления негативной регуляции транскрипции. Исследование структуры этих доменов выявило их большое разнообразие. Наиболее изучены сайленсеры генов дрожжей.

Существуют определенные последовательности нуклеотидов длиной в несколько сотен пар оснований, которые обладают способностью подавлять позитивное и негативное влияние эухроматина и гетерохроматина на экспрессию трансгенов, интегрированных в этот хроматин и фланкированных указанными последовательностями в новом сайте интеграции. Такие участки ДНК как бы изолируют ген, находящийся между ними, способствуя сохранению его обычной пространственной структуры. Эти последовательности известны под названием инсуляторов (англ. insulate - изолировать) и как регуляторные области локусов (LCR - locus control regions). Введение одного из таких элементов между энхансером и промотором регулируемого гена приводит к функциональной изоляции энхансера и подавлению экспрессии гена, а фланкирование гена пограничными последовательностями предохраняет его от инактивирующего действия окружающего конденсированного гетерохроматина, т.е. снимает эффект положения. У высших эукариот энхансер может активировать промотор на расстоянии, достигающем нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов, что является одной из особенностей регуляции транскрипции высших эукариот.


На схеме показано действие инсулятора на  функционирование энхансера с помощью образования нового хромосомного домена.
А  Схема функционирования двух генов (темно-желтый и голубой), локализованных в домене, контролируемом двумя инсуляторами (темно-зеленый) и белками, которые связываются с инсуляторами (желтый). Энхансеры локализуются между двумя генами (вместе с транскрипционными факторами, обозначенными бирюзовым и оранжевым), они могут активировать транскрипцию с промотора каждого гена. В  Если пограничный элемент, например, gypsy-инсулятор (красный) расположен между двымя энхансерами, формируется новый хромосомный домен, в результате голубой ген остается в одном, а темно-желтый- в другом домене. Бирюзовый транскрипционный фактор не может действовать на промотор темно-желтого гена в соответствии с локализацией второго gypsy-инсулятора. Энхансер может активировать транскрипцию с промотора голубого гена, который остался в том же домене.

По сути механизм формирования петли (домена) выглядит так:
 Взаимодействующие белки  инсулятора (голубые и зеленые шары) связываются с инсулятором (красный) и формируют "петлю"- домен. Гены в домене отделены от конденсированного хроматина вне домена, что обеспечивает их независимую регуляцию транскрипционными факторами.

Исследуется множество генов, ассоциированных со старением. Их обнаруживается все больше и больше. Не последнее значение в исследованиях занимает изучение регуляции экспрессии этих генов. Рассмотрим некоторые из них.

 Регукальцин (Regucalcin, RGN), также известный как маркер старения protein-30 (senescence marker protein-30, SMP30). Белок, кодируемый этим геном ввысоко-консервативный кальций-связывающий протеин, преимущественно экспрессирующийся в печени и почках, играет важную роль в гомеостазе кальция. Исследования на крысах показали, что его выключение наблюдается при старении. Является частью кластера генов на X- хромосоме (Xp11.3-Xp11.23). В результате альтернативного сплайсинга образуется два варианта белка. Кроме апоптоза, SMP30 предохраняет клетки от переизбытка кальция. Показано, что мыши с выключенным SMP30 knockout mice (SMP30 knockout mice) имеют низкий вес и небольшую продолжительность жизни,  у них в печени накапливаются нейролипиды и фосфолипиды. SMP30 выполняет и другие важные функции.
Регуляция экспрессии гена на уровне транскрипции осуществляется с помощью взаимодействия регуляторных последовательностей и белков в области промотора.
Индийскими и японскими учеными ,в том числе Naoki Maruyama, руководителем лаборатории из Токийского Института Геронтологии, исследована регуляция этого гена. Выяснено, что важную роль в экспрессии гена играет C/EBPβ- энхансерный белок, который связывается с CCAAT-последовательностью, с которой связываются транскрипционные факторы. По сути эта последовательность является энхансером. Кроме того обнаружен сайт для действия Sp1, который связывается с энхансерной последовательностью и усиливает транскрипцию клеточных и вирусных генов. Показано, что при мутациях одновременно в Sp1 и C/EBPβ значительно усиливают активность гена SMP30. Авторы на основании этого сделали вывод, что правильное или неправильное взаимодействие этих факторов в присутствии некоего другого регулирующего фактора вызывает репрессию промотора гена SMP30. Ученые выявили репрессорный элемент (сайленсер) в этом регионе, делеция которого вызывает снижение активности гена. В этом вопросе остается много неясного, ведутся дальнейшие исследования.

Выше описанный C/EBPβ также имеет значение в регуляции сети цитокинов, тем самым участвуя в индукции воспаления, а затем и онкоген-индуцированного старения и канцерогенезе.  Онкоген- индуцированное старение (OIS)- это состояние пролиферативного ареста, являющееся ответом на клеточный стресс, в том числе повреждение ДНК, действие онкогенов. C/EBPβ (вместе с NF-kappaB) регулирует экспрессию цитокинов, взаимодействующих с CXCR2 (рецептором для ИЛ-8). В лаборатории лондонского MRC Clinical Sciences Centre по руководством Jesús Gil, исследующей клеточную пролиферацию, выявлено, что гиперэкспрессия цитокинов и CXCR2 приводит к онкоген-индуцированному старению, а выключение гена CXCR2 приводит к смягчению OIS и ответа на повреждение ДНК. Тема очень интересная, но многое еще не ясно. Есть ли пути воздействия на транскрипционный энхансерный фактор C/EBPβ и последовательность, с которой он взаимодействует для усиления транскрипции- это еще предстоит определить ученым.

Интересна проблема воздействия на саму некодирующую регуляторную последовательность, но не менее важным является вопрос о воздействии на факторы, которые взаимодействуют с этими последовательностями.
В японском Национальном институте наук о долголетии под руководством Hirokazu KAWAGISHI проведена работа по исследованию регуляции адипогенеза с помощью воздействия Hzf (haematopoietic zinc-finger, гемопоэтический фактор с "цинковыми пальцами") на энхансерный белок C/EBPalpha. Действие C/EBPalpha имеет большое значение в дифференцировке адипоцита. Собственно экспрессию C/EBPalpha контролирует Hzf, он индуцирует дифференцировку адипоцита, и в при его блокировании дифференцировка прекращается. В отсутствии Hzf экспрессия C/EBPalpha прекращается из-за снижения трансляции его мРНК. В процессе старения адипогенез изменяется, возможноопределенное значение здесь имеет экспрессия энхансерных факторов.

Энхансеры, инсуляторы, сайленсеры во многом определяют экспрессию генов. Эти проблемы сейчас находятся еще в стадии разработки, по всему миру идут интенсивные исследования, также необходимо правильно интерпретировать и систематизировать полученные данные. Но остается много вопросов:
1) каковы механизмы регуляции генетической активности с помощью этих последовательностей,

2) какие факторы взаимодействуют с ними,

3) какие факторы могут влиять на последовательности и связывающиеся с ними белки,

4) какова роль этих взаимодействий в процессе старения и возникновения возрастассоциированных заболеваний,

5) возможно ли влияние на них в терапевтических целях.
На эти и многие другие вопросы предстоит ответить ученым.

21 сентября 2008 года