13
15357

Методы перепрограммирования соматических клеток

Компас посвящен интенсивно развивающемуся направлению биотехнологии- методам перепрограммирования соматических клеток

на сайте с 27 августа 2008

Актуальность вопроса

Стволовая клетка Количество болезней,известных человечеству неисчислимо- ишемическая болезнь, диабет, ожирение и т.д. Плохая экология,нездоровый образ жизни,стресс приводят к ускорению естественного износа организма. Но очень скоро, благодаря новейшим исследованиям фантастика станет реальностью- ученые научатся выращивать из соматических клеток органы и ткани человеческого организма. Каким же образом? С помощью перепрограммирования. С помощью этого комплекса методов будет решена проблема дефицита донорских органов, проблема поиска подходящего донора, а также все проблемы,которые возникают при трансплантации чужеродной ткани (отторжение, иммуносупрессия и т.д.), т.к. для выращивания будут использованы клетки самого больного. Также, с помощью таких разработок, решаются этические и технические вопросы,связанные с использованием эмбриональных стволовых клеток.

Существующие методы

Методы перепрограммирования соматических клеток Каковы на сегодняшний день методы перепрограммирования? Их 3:
1. Перенос ядра специализированной клетки в эмбриональную стволовую клетку(Nuclear transfer)
2. Слияние дифференцированной клетки и эмбриональной (Fusion)
3. Использование ретровирусных векторов с генами плюрипотентности(Retroviral transduction of embryonic genes)

Общий смысл перепрограммирования (верхняя часть схемы) заключается в том,чтобы ввести в эмбриональную клетку (клетку зародыша) генетический материал (в виде ДНК) дифференцированной клетки (клетки взрослого организма). Таким образом полученная клетка становится плюрипотентной,т.е. она не строго детерминированна (направленна в своем развитии), как дифференцированная, а имеет несколько возможных путей развития, что можно использовать для выращивания различных тканей.

Перенос ядра (Nuclear transfer)

nuclear transfer Впервые перепрограммирование клетки было осуществлено с помощью nuclear transfer, именно так была получена зигота, из которой развилась знаменитая овечка Долли. Ядро зрелой клетки пересадили в неоплодотворенный ооцит (яйцеклетку). Успех этого и подобных экспериментов породил в научном мире целый бум клонирования. Методика переноса ядра отработана и используется во всех лабораториях,изучающих стволовые клетки. Упрощенно схему эксперимента можно представить таким образом:

В начале осуществляют забор необходимых клеток у пациента.
a) - Ядро из клетки пациента помещают в ооцит, из которого предварительно удалили ядро.
b) - Полученная гибридная клетка развивается до стадии бластоцисты.
c) - Полученная бластоциста культивируется.
d) - Эмбриональные клетки размножаются.
e) - После направленной дифференцировки исследуемые (или необходимые для терапевтического использования) клеточные ростки изолируются.
f) - Затем они вводятся пациенту, у которого исходно брали клетки.
Полученные клетки генетически идентичны клеткам донора. Таким образом возможно выращивание необходимых тканей и органов, разработки в этой области ведутся особенно интенсивно. Перспективность этой технологии несомненна, уже сейчас ведутся разработки по выращиванию заменителей органов,которые можно будет пересаживать человеку. Это реальный путь к лечению тяжелых заболеваний и продлению жизни.

Техническая сторона вставки ядра

Вставка ядра-тонкий сложный процесс. Помимо рук экспериментатора необходим микроскоп, маленькая пипетка, обеспечивающая вакуум, микропипетка, с помощью которой и осуществляется введение ядра в клетку.
В эксперименте используются различные реагенты :ингибиторы микротрубочек (нокодазол) используются для остановки яйцеклетки в М-фазе клеточного цикла (фазе митоза). Также используются различные реагенты для стимуляции яйцеклетки.

Вставка ядра (Nuclear transfer)

Слияние клеток (fusion)


Разработка и развитие этого метода активно идут в Гарвардском университете.В 2005 году Кевин Эгган  и его сотрудники разработали метод генетического перепрограммирования соматических клеток.
Они взяли фибробласты – активно делящиеся клетки соединительной ткани – и добились их слияния с человеческими ЭСК (эмбриональными стволовыми клетками) из уже существующих линий. В результате получились гибридные тетраплоидные клетки (т.е.имеющие 4 набора хромосом, в отличие от двойного набора у всех человеческих клеток, кроме половых, у которых один набор), обладающие двумя парами хромосомных наборов. Примерно в каждой тысячной из таких химерных клеток (т.е. клеток, содержащих наборы хромосом от разных клеток) гены фибробластов как бы вернулись в эмбриональное состояние и со стартовой позиции запустили процесс клеточной специализации. Экспериментаторы наблюдали превращение этих «избранных» гибридов в клетки нервной и мышечной ткани, а также в клетки волосяных фолликулов.
Правда, для получения лечебных стволовых клеток такой метод не годится. Клетки-гибриды необходимо сделать диплоидными, содержащими исключительно хромосомы фибробластов.

Каким же образом можно устранить тетраплоидность? Одна из последних методик была предложена Matsumura H и Tada T из Университета Киото в 2008 году. Она заключается в том,что исходно в хромосому эмбриональной клетки встраивали комплекс генов (chromosome elimination cassette (CEC)) , обеспечивающх резистентность (устойчивочть к некоторым антибиотикам), а также ген GFP. Последовательность комплекса была фланкирована (отмечена,ограничена) инвертированными (обратно- ориентированными) loxP сайтами, для того,чтобы между хромасомами произошла рекомбинация. GFP- положительная ЭСК (эмбриональная стволовая клетка) со встроенным CEC гибридизовалась (сливалась) со зрелыми тимоцитами (клетка тимуса) , а затем подвергалась воздействию Cre-рекомбиназы. Это приводило к потере экспрессии GFP  и элиминированию (удалению из ядра) CEC-меченной хромосомы. Направленное удаление пары хромосом ЭСК доказывает, что перепрограммирующих факторов соматической клетки достаточно, чтобы поддерживать плюрипотентность (т.е. возможность нескольких путей развития клетки) гибридной клетки. Такая методика позволит создавать персональные стволовые клетки,что открывает значительные перспективы для применения в медицине.

Техническая сторона (слияния клеток) fusion

Искусственное слияние исследуемых клеток одного и того же или разных организмов с использованием вирусов (например, вируса Сендай), химических агентов (этиленгликоль и др.) или облучения. После воздействия агента клетки культивируются на питательных средах для дальнейшего изучения.

Использование вирусных векторов (retroviral transduction)

Shinya Yamanaka Этот метод перепрограммирования в 2006 году предложил Shinya Yamanaka из Университета Киото и в 2007 году Джеймс Томсон (James Thomson) из Университета Висконсина.
Суть метода заключается в том, что в геном соматической клетки вводятся эмбриональные гены, экспрессия которых делает клетку плюрипотентной. Введение генов осуществляется с помощью ретровирусных векторов (специальных генноинженерных конструкций). В природе ретровирусы обладают ферментом- ревертазой, с помощью которой они могут встраиваться в геном клетки и экспрессировать свои гены. Это видно на схеме:


1 - Из ретровирусного генома получают новый рекомбинантный (т.е. искусственный, содержащий гены донорского организма (или в данном случае вируса) и исследуемые гены) геном. Клетки пациента подвергают воздействию ретровируса ex-vivo, т.е. вне организма пациента.
2 - Рекомбинантная вирусная частица взаимодействует с рецепторами на поверхности клетки пациента.
3 - После связывания рецепторов в клетку проникает вирусный РНК-геном и фермент - обратная транскриптаза (ревертаза).
4 - Ревертаза синтезирует ДНК- копию ретровирусного генома.
5 - Клетка синтезирует копию ДНК-копии вируса и эта цепочка транспортируется в ядро.
6 - Эта цепь ДНК в ядре интегрируется (встраивается) в хромосому клетки. С этого момента экспрессия вирусных генов идентична экспрессии генов пациента.
7 - Гены транскрибируются в мРНК.
8 - Затем происходит трансляция и образуются терапевтические протеины.
9 - Так же синтезируются новые вирусные белки, образуются новые вирусные частицы (вирионы).
10 - Образовавшиеся вирионы выходят из клетки.
11 - Цикл начинается заново с другими клетками.

Было показано, что введение с помощью ретровируса четырех транскрипционных факторов (Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc) во взрослые дифференцированные клетки приводит к их переходу в плюрипотентные стволовые клетки. В2007 году Rudolf Jaenisch из Университета Масачусетса и Whitehead Institute for Biomedical Research (Cambridge, MA) повторил эти опыты, заменив протоонкогенный c-Myc на более «безопасный» Nanog.
В Европе, Америке и Японии интенсивно ведутся разработки в этой области. Так, недавно японским ученым Aoi T, Yae K, Nakagawa M, Ichisaka T, Okita K, Takahashi K, Chiba T, Yamanaka S удалось перепрограммировать клетки печени и желудка мышей. В эксперименте в клетки-реципиенты с помощью ретровирусных векторов ввели 4 эмбриональных гена, необходимых для развития эмбриона. Гены вводили в малых дозах, что позволило избежать малегнизации (озлокачествления).

Техническая сторона использования вирусных векторов

Генно-инженерными методами в ретровирусный вектор встраиваются необходимые гены. Затем исследуемые клетки культивирутся в среде с добавление ретровируного вектора. В процессе культивирования вектор встраивается и далее происходят процессы по вышеописаной схеме.

Есть ли другие методы?

В подавляющем большинстве экспериментов используют вышеописанные методы перепрограммирования, но ведутся разработки и по другим методам.
В Юго-Западном медицинском центра Техасского университета выполнены эксперименты на животных, в ходе которых был опробован принципиально новый способ лечения острых нарушений сердечной деятельности.
Исследователи из Далласа решили воспользоваться недавно доказанной возможностью генного перепрограммирования обычных соматических клеток, наделяющего их способностью превращаться в клетки другого типа. В качестве исходного сырья Джей Шнайдер и его коллеги использовали периферические мононуклеарные клетки, одну из многочисленных разновидностей клеток белой крови. Они подвергли их воздействию нескольких синтетических веществ, способных запустить генную перестройку в нужном направлении. Предварительно ученые протестировали без малого полтораста тысяч различных соединений и в конце концов вышли на семейство молекул, обладающих нужной биологической активностью.
В главной фазе эксперимента исследователи в течение трех суток размножали человеческие периферические мононуклеарные клетки на питательной среде, в которую были добавлены отобранные биостимуляторы. Еще через несколько дней потомки исходных кровяных клеток претерпели столь значительные генные перестройки, что стали синтезировать специализированные белки, которые в норме производят клетки сердца.
Эти перепрограммированные клетки были имплантированы непосредственно в сердечную ткань крыс, у которых был искусственно вызван некроз части сердечной мышцы. Всего лишь через неделю после имплантации состояние животных заметно улучшилось, а еще через полмесяца у них полностью восстановился нормальный ритм сердечной деятельности.
Новая терапевтическая техника в принципе очень перспективна. Возможность переделать клетки крови больного в ремонтный материал для устранения повреждений сердечной мышцы обещает полностью революционизировать лечение инфарктов. Однако ученым и врачам еще предстоит проделать множество опытов на животных прежде чем появится возможность перейти к клиническим испытаниям этого метода.

Вместо заключения...

Недавно появилась информация, что американские ученые смогли перепрограммировать зрелые клетки внутри живого животного. Может быть мы вступаем в новую эру? Эру победы над болезнями, эру долголетия...
Как бы то ни было, необходимы исследования, необходима совместная работа многих и многих ученых, помощь и поддержка правительств многих стран. Тогда и только тогда человечество преодолеет старение, и в 100-ый день рождения все будет только начинаться...

28 августа 2008 года

Комментарии

5 января 2010 в 02:19
 
Звучит заманчиво
20 февраля 2014 в 11:42
 
Я пишу в на своем сайте достаточно часто и благодарен за http://lynxconcept.com/ вашу статью. Последняя статья вызвала во мне интерес. Я внесу ваш дневник в свои закладки и надеюсь иногда просматривать в поиске новостей. Подписался на ваши обновления.

Оставить комментарий

Поделиться с друзьями

Share on Twitter