Наука | 
на сайте с 15 января 2009

Введение

 В течение долгого времени регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции считалась одним из основных механизмов адаптивного клеточного ответа на различные стрессы. Однако, за последние 10 лет накопилось большое количество фактов, свидетельствующих о наличии сложной, чувствительной и чрезвычайно важной системы регуляторных связей, основывающихся на белок-белковых взаимодействиях, пост-трансляционных модификациях и протеолизе. Протеолиз является одной из тактик, применяемой клеткой для необратимой инактивации белков и регуляции клеточного протеома. Клетки млекопитающих обладают целым набором механизмов деградации белков: лизосомальные протеазы, кальций-зависимые протеазы, протеасомы и митохондриальные протеазы. Лизосомы и протеасомы играют главную роль в процессе "кругооборота" белка в клетке. Этот постоянный процесс является чрезвычайно важным для клетки, так как обеспечивает деградацию белков с неправильной структурой. Изменения в сопряженных процессах синтеза и распада белка наблюдаются при различных патологических состояниях, в том числе и при старении клетки, а также могут и приводить к нему.

Как осуществляется внутриклеточная деградация белков?

Внутриклеточная деградация белков представляет собой физиологический процесс, вовлеченный  в регуляцию большого числа клеточных активностей: продвижение клетки по клеточному циклу, регуляция транскрипции, репликации, контроль протеома.  Различные протеолитические механизмы отвечают на различные физиологические потребности клетки и позволяют клетке приспосабливаться к меняющимся условиям среды. Первыми в 1949г бельгийским цитологом Christian de Duve были открыты лизосомы, как структуры, содержащие большое количество гидролитических ферментов, активных при кислых значениях рН. Деградация в лизосомах осуществляется неспецифично. Интересно, что в лизосомах показано наличие участков, свободных от гидролаз. Протеасомы были впервые описаны в 1977г Alfred Goldberg из Harvard Medical School. Деградация в протеасомах является гораздо более специфичной. Считается, что 90% внутриклеточных белков, включая ядерные, деградируют в протеасомах.

Структура протеасом

Протеасомы являются крупными мультикаталитическими протеазами, которые обнаруживаются как в цитоплазме, так и в ядре, и составляют до 1% белка в цитоплазме. В цитоплазме протеасомы ассоциированы с центросомами и компонентами цитоскелета. Также в цитоплазме протеасомы обнаруживаются на поверхности эндоплазматического ретикулума. Внутриклеточное распределение протеасом сильно зависит от типа клеток и от дифференцировки клеток. Показано, что активно пролиферирующие клетки, а также трансформированные клетки обладают большей протеасомной активностью. В ядре протеасомы локализуются как в транскрипционно активном эухроматине, так и в гетерохроматине. До последнего времени точно не установлено, как протеасомы, достаточно крупные структуры, попадают в ядро. Известно, что некоторые протеасомные субъединицы несут сигнал ядерной локализации. Показано, что при апоптозе протеасомы транспортируются обратно, из ядра в цитоплазму.


Протеасома - это мультидоменный комплекс, состоящий из 20S коровой части (700кДа), несущей каталитические и регуляторные частицы 11S и 19S. Связывание 11S и 19S частиц с коровой частицей приводит к разнообразию вариантов протеасом. 26S протеасома образуется в результате связывания 2 регуляторных 19S  частиц с 20S протеасомой и характеризуется различной субстратной специфичностью. Большинство белков направляются в 26S протеасому после ковалентного прикрепления к ним полиубиквитиновой цепочки. Ключевым компонентом этого энзиматического каскада является фермент убиквитин-лигаза, контролирующий специфичность процесса. 26S протеасома осуществляет АТР-зависимую деградацию полиубиквитинилированных белков до маленьких пептидов. Это отличает ее от 20S протеасомы, разрушающей белки АТР- и убиквитин-независимым способом. Функциями 19S субчастиц в 26S протеасоме являются распознавание и денатурация полиубиквитинилированных субстратов, а также перенос их в протеалитическую полость в протеасоме. Поскольку данные функции требуют энергии, каждая 19S частица несут 6 АТРаз.


Убиквитин является одним из наиболее консервативных белков у эукариот и представляет собой маленький белок, состоящий из 76 аминокислот. Присоединение его к другим белкам осуществляется в несколько стадий, на каждой из которых действует свой фермент. В начале происходит активация убиквитина посредством связывания в присутствие АТР с убиквитин-лигазой Е1 через высокоэнергетическую связь. Далее активированный убиквитин переносится на следующий фермент убиквитин-лигазу Е2. В конечном счете, убиквитин связывается со своим субстратом через консервативный С-концевой остаток глицина убиквитина и ε-аминогруппу остатка лизина субстрата. Во многих случаях перенос убиквитина от фермента Е2 на субстратный белок требует участия дополнительного фермента убиквитин-лигазы Е3. Последующее связывание дополнительных молекул убиквитина приводит к формированию полиубиквитинилированных цепочек, направляющих модифицированный таким образом белок для деградации в 26S протеасомы. Описано большое количество субстратов убиквитина, среди них белки, вовлеченные в клеточный цикл, сигнальные механизмы, клеточный метаболизм, канцерогенез и др.


Все клеточные компоненты аэробных живых организмов постоянно подвергаются окислительным модификациям, вызванным действием активных форм кислорода (ROS). Количество окисленных молекул в клетке с возрастом увеличивается. Модификации клеточных компонентов могут быть индуцированы непосредственным формированием ROS вследствие облучения, воздействия токсинов из окружающей среды или некоторых противоопухолевых лекарств. Воздействие ROS на ДНК вызывает различные повреждения: мутации, обрыв цепей ДНК, делеции и ряд других (ссылка на компас). Свободные радикалы также могут вызывать окисление аминокислотных остатков белков, гликозилирование, дезаминирование, образование поперечных сшивок и фрагментацию белков (ссылка на компас). Подобные повреждения происходят как в ядре, так и в цитоплазме. В лаборатории проф.Tilman Grune из университета Hohenheim показали, что окислительный стресс снижает активность 26S протеасомы, в то время как 20S протеасома является более устойчивой к окислительному повреждению.

Протеасома: фактор и мишень старения

Достаточно хорошо изучено, что при старении уровень синтеза и распада белка в клетке падает, а окисленные и другим образом поврежденные белки накапливаются. Накопление поврежденных белков в клетке коррелирует с уменьшением количества протеасом в разных типах клеток. В лаборатории Efstathios S. Gonos из Institute of Biological Research and Biotechnology обнаружено, что у здоровых долгожителей количество и активность протеасом сопоставимы с аналогичными показателями у молодых здоровых доноров. Снижение протеасомной активности с возрастом может осуществляться через регуляцию на уровне транскрипции. Также с возрастом может происходить увеличение экспрессии ингибиторов протеаз. В некоторых тканях при старении количество протеасом не меняется, что может быть связано с качественными изменениями в системе протеасомной деградации. Итальянскими исследователями из University of Modena and Reggio Emilia показано изменение субъединичного состава протеасом при старении. Сшитые между собой продукты окислительной деградации клеточных компонентов, так называемый липофусцин, активно накапливающийся в цитоплазме клеток при старении, способен необратимо ингибировать протеасому и усиливать процессы старения. Кроме того, липофусцин активнее накапливается у мутантных организмов с ускоренным старением. Пролиферативный статус клеток оказывает влияние на возраст-опосредованные функций протеасом.  Пост-митотические клетки подвержены более сильному ингибированию функций протеасом, чем делящиеся клетки. При этом отмечены различия в ингибировании различных протеалитических активностей протеасомы. Датскими исследователями обнаружено, что при старении изменяется способность протеасом отвечать на стрессовые воздействия.

Ингибирование протеасом, как следствие старения


На настоящее время доказано, что вызванные старением нарушения протеасомной системы деградации белков могут затрагивать различные аспекты: доставку белка в протеасомы, образование кросс-сшитых субстратов, взаимодействия с белками теплового шока (HSPs), изменения в структуре протеасом.

Увеличение гидрофобности белка за счет присоединения специальных меток является центральным механизмом узнавания белка протеасомой для последующей деградации.  В стареющих тканях происходит усиление загрузки протеасом за счет большого количества
окисленных белков, белков с нарушенной укладкой, или иным образом поврежденных белков.
Подобное огромное количество белков-субстратов приводит к неэффективной работе
протеасомной системы в целом. Кроме того, часть белков может не достигнуть протеасом.

В то время как слабое окисление белков служит индуктором протеасомного протеолиза, чрезмерное окисление, наоборот, ингибирует протеасомы. Подобное воздействие за счет ROS или продуктов окисления липидов часто происходит при старении и может приводить к образованию кросс-сшитых белков, которые не способны попасть в протеасомный комплекс. Также кросс-сшитые белки затрудняют денатурацию белков, что мешает протеолизу в протеасомах.

Повышенная температура и прочие стрессовые для клеток условия активируют синтез HSPs,
большинство из которых являются шаперонами (ссылка на компас). Показано, что HSPs ассоциированы с протеасомами, играют роль в их сборке и функционировании, облегчая деградацию неправильно свернутых белков, как альтернатива механизму рефолдинга. Механизмы взаимодействия между протеасомой и HSPs стали проясняться после открытия белков CHIP и BAG-1. CHIP – это Е3 убиквитин-лигаза, связывающаяся с Hsc/Hsp70, подавляет их шаперонную активность, что приводит к протеасомной деградации несвернутых белков. BAG-1 связывается с Hsc/Hsp70 и соединяет их с 26S протеасомой. Выбор между рефолдингом и протеасомной деградацией принимается в результате сложной конкуренции между белками Hip и BAG-1 с одной стороны и белками Hop и CHIP с другой стороны. На различных модельных системах продемонстрировано, что при старении снижается стресс-индуцируемая экспрессия как Hsp70, так и Hsp90. Дефицит шаперонов уменьшает деградацию белка в клетке и может приводить к перегрузке протеасом. Qunxing Ding и Jeffrey N. Keller из University of Kentucky получили данные, что усиление экспрессии HSPs приводит к отмене ингибирования протеасом за счет окислительного стресса.


Постоянное образование новых протеасомных комплексов необходимо для замены поврежденных и/или низкоэффективных протеасом. Однако, подобное постоянное обновление пула протеосом приводит к образованию некоторого количества протеасом с измененным составом или с полиморфизмами, влияющими на работу субъединиц протеасом. Так, показаны четкие связи между полиморфизмами субъединиц и базедовой болезнью, болезнью Бехтерева, инсулин-зависимым сахарным диабетом. Изменения  в экспрессии субъединиц отмечены при старении фибробластов, мышечной ткани и ряда других.

Ингибирование протеасом, как медиатор старения


Ингибирование протеасомных функций приводит к появлению многочисленных патологических изменений, ассоциированных со старением: окисление белков и нуклеиновых кислот, агрегация белков, образование липофусцина, активация аутофагии. Разными научными группами доказана связь клеточного старения  с потерей клеткой протеасомных функций. Более того, показано, что ингибирование протеасом достаточно для появления различных признаков клеточного старения. 

Ограничение количества калорий, поступающих с пищей (caloric restriction CR), является единственно широко продемонстрированным способом, увеличивающим продолжительность жизни у млекопитающих (как среднюю, так и максимальную) (ссылка на компас). В ряде работ показано положительное влияние CR на возраст-зависимые изменения протеасом. В University of North Texas обнаружили, что CR также связано с усилением защиты от окислительного стресса, что, возможно, является механизмом восстановления активности протеасом. Важным моментом является установление роли протеасом непосредственно в регуляции продолжительности жизни. Так, исследователями из Sanders–Brown Center on Aging под руководством Ismail S. El-Amouri и Jeffrey N. Keller на модели дрожжей показали, что протеасома играет ключевую роль в процессах старения, а также, что уменьшение протеасомной деградации белков приводит к уменьшению продолжительности жизни.

В заключение

Подводя итоги можно отметить что, протеасома непосредственно участвует в регуляции процессов старения, при восстановлении функций протеасом замедляется скорость старения, а ингибирование протеасом ускоряет старение. Снижение эффективности работы протеасомной системы деградации белков приводит к избыточному накоплению клеточного мусора, что еще больше затрудняет нормальные процессы в клетке. Изучение тонкой регуляции работы протеасомной системы в условиях старения и окислительного стресса  необходимо для более полного понимания возраст-зависимых изменений в "кругообороте" белка в клетке. Среди нерешенных вопросов можно выделить проблемы раздельной регуляции 20S и 26S протеасом при стрессах, а также механизмы повышенной активности протеасом в опухолевых клетках.

Комментарии

21 августа 2009 в 08:51
 
Очень интересная статья, хорошее изложение материала, правильные выводы.
21 августа 2009 в 08:51
 
Очень интересная статья, хорошее изложение материала, правильные выводы.
автор
21 августа 2009 в 10:39
 
спасибо)

Оставить комментарий

Поделиться с друзьями

Share on Twitter