Регуляторы экспрессии из группы белков Поликомб и Триторакс

Многочисленные онтогенетические решения - включая детерминацию судеб клеток - осуществляются в ответ на временную позиционную информацию у ранних эмбрионов. Эти решения зависят от изменений в генной экспрессии. Это позволяет клеткам с идентичными генетическими программами приобретать уникальные характеристики и следовать самостоятельными путями дифференцировки. Изменения в генной экспрессии, лежащие в основе детерминации судеб клеток являются наследуемыми; клеточные судьбы редко изменяются, будучи однажды детерминированными, даже после многочисленных клеточных делений и длительных периодов процесса развития.

Многие регуляторные белки, участвующие в поддержании наследуемых состояний генной экспрессии, были идентифицированы в исследованиях Drosophila гомеозисных (Hox) генов. Hox гены кодируют гомеодоменовые транскрипционные факторы, которые регулируют транскрипцию батарей нижестоящих генов мишеней, которые в свою очередь определяют качественные особенности сегментов тела. У Drosophila, Hox гены обнаружены в двух генных комплексах: the Antennapedia complex (ANT-C), который содержит Hox гены labial (lab), Deformed (Dfd), Sex combs reduced (Scr) и Antennapedia (Antp); и bithorax complex (BX-C), который содержит Hox гены Ultrabithorax (Ubx), abdominalA (abdA) и AbdominalB (AbdB). Каждый Hox ген определяет характеристики определенного сегмента или группы сегментов, вдоль передне-задней оси развивающихся мух. Например, Antp специфицирует характеристики второго торакального сегмента, включая вторую пару ног, тогда как Ubx специфицирует качественные особенности третьего торакального сегмента, включая балансеры, расположенные позади крыльев. Таким образом, кодируемые Hox генами функционируют как мастера регуляторного переключения, которые управляют выбором между альтернативными путями развития.
Транскрипция Hox генов должна регулироваться точно, т.к. драматические альтерации в клеточных судьбах могут происходить в результате несоответствия экспрессии. Например, согласно Kingston  J.W.Tamkun дерепрессия Antp в головных сегментах трансформирует антенны в конечности, а инактивация Ubx в торакальных сегментах трансформирует балансиры в крылья. У Drosophila, инициальные паттерны транскрипции Hox устанавливаются в раннем эмбриогенезе с помощью транскрипционных факторов, кодируемых сегментационными генами. Белки, кодируемые сегментационными генами - включая gap, pair-rule и сегментной полярности гены - подразделяют ранний эмбрион на 14 идентичных сегментов.
Эти белки также устанавливают инициальные паттерны Hox транскрипции, первую ступень в направлении развития сегментов с определенными характеристиками и морфологией. Будучи предопределены, сегментно ограниченные паттерны транскрипции Hox должны поддерживаться в течение всего последующего эмбрионального, личиночного и куколочного развития, чтобы сохранять качественные особенности индивидуальных сегментов тела. Т.к. большинство сегментационных генов временно экспрессируются во время раннего развития, то эту функцию выполняют две другие группы регуляторных белков: Polycomb группа репрессоров (PcG) и trithorax группа транскрипционных регуляторов (trxG) (См.схему).

Регуляция транскрипции Hox следовательно, состоит, по крайней мере, из двух самостоятельных фаз: установление (с помощью сегментационных генов) и поддержание (с помощью PcG и trxG генов)

Функциональные аналоги практически всех Drosophila trxG белков присутствуют у млекопитающих, включая и человека. Генетические и биохимические исследования показали, что белки мух и млекопитающих играют высоко законсервированную роль как в экспрессии генов, так и в развитии. Прекрасным примером функциональной консервации белков trxG является MLL, ортолог (сходный по строению) у млекопитающих гена Drosophila trx. Мутации в MLL вызывают гомеозисные трансформации осевого скелета мышей, обусловленные неспособностью поддерживать активную транскрипцию Hox генов. И MLL и trx функционируют как гистоновая метилтрансфераза (HKMTs), a прямые доказательства функциональной гомологии между ними получены с использованием человеческого MLL для частичного восстановления онтогенетических дефектов, возникающих в результате потери функции trx у мух . Таким образом, механизмы, лежащие в основе поддержания детерминированного состояния высоко законсервированы в ходе эволюции.
Рак и другие заболевания человека могут быть результатом неспособности поддерживать наследуемое состояние генной экспрессии. Не удивительно, что большинство генов PcG и trxG человека действуют как прото-онкогены или гены супрессоры опухолей. Например, ген trxG человека MLL первоначально идентифицированный с помощью хромосомной транслокации llq23, ассоциирующей с лимфобластным (ALL) или миелоидным (AML) лейкозом. Мутации в других генах trxG млекопитающих также ассоциированы с разнообразными раковыми заболеваниями. Например, BRG1, человеческий аналог Drosophila brm, физически взаимодействует с белком, супрессирующим ретинобластому, нарушение этого взаимодействия увеличивает клеточные деления и злокачественную трансформацию определенных линий опухолевых клеток человека. В соответствии с ролью BRG1 в супрессии опухолей, мыши, гетерозиготные по мутации в этом гене, склонны к развитию разнообразных опухолей . Мутации в INI1, человеческом аналоге Drosophila trxG гена, SNF5-related gene 1 (SNR1), также вызывают предрасположенность индивидов к раковым заболеваниям и идентифицируются в высоком проценте злокачественных опухолей (например, рабдомиом), агрессивного рака у детей . Эти и другие взаимосвязи с болезнями людей подтолкнули исследователей к поиску механизмов действия trxG белков.
Группа trxG активаторов является крупной функционально разнообразной группой регуляторных белков. Это может отражать сложность эукариотической транскрипции, которая использует высоко регулируемые взаимодействия между ген-специфическими транскрипционными активаторами, многочисленными компонентами общего транскрипционного аппарата и матричной ДНК, которая транскрибируется. При активации транскрипции происходит связывание белков-активаторов со специальными последовательностями, рекрутирование общего транскрипционного аппарата с помощью этих белков, образование пре-иниационного комплекса с РНК полимеразой II, связанной с промотором, открытие ДНК спирали вблизи промотора, эффективное удаление РНК полимеразы с промотора и эффективная элонгация РНК полимеразы по гену.
Способность поддерживать активное транскрипционное состояние может быть связана с несколькими из многочисленных ступеней, необходимых для активации, т.к. для каждого данного гена разные ступени могут играть скорость-лимитирующую роль для транскрипционной активности. Упаковка эукариотической ДНК в хроматин создает другой уровень, на котором trxG белки могут регулировать транскрипцию. Нуклеосомы и другие компоненты хроматина имеют тенденцию ингибировать связывание общих и ген-специфических транскрипционных факторов с ДНК, также как и ингибировать элонгацию РНК полимеразой. Альтерации в структуре хроматина - включая изменения в структуре или позиционировании нуклеосом - может действительно влиять на каждую из ступеней процесса транскрипции.
Любой белок, который необходим для транскрипции, необходим для поддержания активного состояния. В самом деле, некоторые trxG белки играют довольно общие роли в транскрипции и не посвящены исключительно поддержанию детерминированного состояния. Другие trxG белки, однако, могут играть специализированные роли в этом процессе, или путем непосредственного противодействия PcG репрессии или путем поддержания наследуемых состояний генной активности в ходе репликации ДНК и митозов. Последний класс trxG белков особенно интересен для биологи развития.

Как говорилось выше, другими модуляторами хроматина являются белки семейства Polycomb (PcG). Согласно исследованиям, они выполняют важную роль в регуляции HOX-генов, вызывая их инактивацию, и являются антагонистами белков trx. Биохимический анализ показал, что повсеместно экспрессирующиеся Pc-G белки как млекопитающих, так и мух формируют большие (~2–5 Md) комплексы. Такие комплексы искусственно метились с помощью промотор-репортерных конструкций, то наблюдали существенную репрессию — как эписомно расположенных, так и и интегрированных в хромосомы репортерных генов. то может указывать на неспецифичность функции репрессии, in vivo Pc-G комплексов. Это хорошо иллюстрируется слабыми изменениями паттерна генной экспрессиии специфических Hox-генов в ответ на изменения дозы одиночных Pc-G генов у мыши. Выявлено существование двух отличных Pc-G белковых комплексов в клетках как у Drosophila так и млекопитающих. Фенотипический анализ мутантов Drosophila и мыши указывает на разные функции этих разных комплексов. Комплекс состоящий из Extra sex combs (Esc) и Enhancer of zeste (E[z]) белков необходим на стадии инициации, когда Pc-G репрессия необходима для освобождения от рано действующих репрессоров, таких как Hunchback (Hb). Второй комплекс, содержащий большинство Pc-G белков, таких как Pc, Psc, Ph, постоянно необходим для стабильного поддержания инициированной Pc-G репрессии специфических генов-мишеней.

Важный вопрос связан с функциональным взаимоотношением между PcG репрессорами и trxG активаторами. Выполняют ли эти регуляторные белки независимые роли в активации репрессии, или они действуют в прямой оппозиции, чтобы поддерживать наследуемое состояние? Недавние генетические исследования показали, что удаление PcG комплексов может реактивировать гены даже в отсутствие TRX и ASH1 , указывая тем самым, что trxG белки с гистон-метилтрасферазной активностью могут функционировать как PcG анти-репрессоры, как противоположность активаторам.

Гипотеза о (a,b) Pc-G репрессии и (c,d) trx-G активации. Гены-мишени (такие как Hox гены) могут или быть репрессированы (a) или активированы (b) ранними ДНК-связывающими факторами такими как Hunchback (Hb) и Fushi tarazu (Ftz). Это ведет к вовлечению или dMi-2/гистон деацетилазы (HDAC) и Pc-Gi белковых комплексов к репрессируемым промотор/PRE (Polycomb-responsive element) или, в случае активного промотора, к активации РНК-полимеразы II (голоэнзим-неактивная форма) и ассоциированных хроматин- ремодулирующих комплексов, таких как SWI/SNF and GAGA/NURF. (b) Локальное деацетилирование гистонов вместе с Pc-Gi белками, по-видимому, индуцирует изменения в конформации хроматина, что позволяет Pc-Gm комплексам связываться и стабильно поддерживать репрессию. (c) Напротив, РНК-полимеразы II (голоэнзим-неактивная форма) и хроматин-ремодулирующие комплексы обеспечивают изменения структуры хроматина, вместе с ДНК- связывающими trx-G белками (такими как trx и GAGA) и вообще рекрутируют гистоновые ацетилазы (HAT) для стабилизации индукции (d) гиперацетилированный активный PRE. По-видимому,иная, чем у мух и все еще плохо изученная, инициация экспрессии Нох генов у млекопитающих может сопровождаться ранней фазой открытия хроматина ('chromatin-opening' phase) . Это должно обеспечиваться сходными консервативными и у млекопитающих trx-G белковыми комплексами и ремодулирующими факторами. Сходным образом, Pc-Gi белки и Mi-2/HDAC комплексы могут обеспечивать раннее репрессивное состояние Hox-кластеров, которое поддерживается затем с помощью консервативных Pc-Gm комплексов млекопитающих тех генов, которые не были активированы. Подобно Hox-кластерам генов у млекопитающих также и Pc-Gm гены дуплицируются в ходе эволюции, существенно увеличивая число потенциально возможных комплексов Pc-Gm в соответствии с увеличением числа генов-мишеней.
По-другому это можно представить так:

Как биохимический, так и генетический анализ предоставили доказательства, что возможны непосредственные взаимосвязи между trxG функцией и PcG функцией. Одним из интересных свойств PcG белков является то, что они способны репрессировать транскрипцию, если прикреплены вблизи фактически любого гена, транскрибируемого с помощью РНК полимеразы II. Члены trxG, которые играют глобальные роли в транскрипции - включая BRM, KIS и др. членов trxG, участвующих в ремоделировании хроматина - являются таким образом прекрасными кандидатами на роль непосредственных мишеней для PcG репрессоров. Один из крупных PcG комплексов, PRC1, блокирует функцию ремоделирующих комплексов семейства SWI/SNF, возможно путем блокирования доступа этого комплекса к матрице. Это согласуется с мнением, что один механизм PcG репрессии может предупреждать АТФ-зависимое ремоделирование с помощью членов trxG. Комплекс Brahma и PRC1 еще более оказываются взаимосвязанными благодаря тому факту, что оба непосредственно взаимодействуют с белком Zeste, который играет сложную роль в регуляции экспрессии генов у Drosophila, что может помогать прямому взаимодействию между этими комплексами.
Второй белок, который соединяет PcG белки и trxG блки, это GAGA фактор, который кодируется с помощью Trithorax-like гена и является таким образом членом trxG. Этот белок может действовать как белок- активатор в некоторых промоторах, но также является членом семейства белков, которые соединяются с Polycomb Repressive Element (PRE). PRE- последовательности управляют функцией PcG и, по крайней мере, один PRE может действовать как модуль памяти, если прикреплен к репортерной конструкции, подчеркивая важность этой последовательности. Последовательность, которая связывает GAGA фактор, играет важную роль в функции PRE, а прикрепление GAGA белка к ДНК, как полагают, усиливает связывание и функционирование PRC1. Таким образом, GAGA фактор может играть ключевую роль в поддержании активации (благодаря своим свойствам активирования транскрипции) и поддержании репрессии (благодаря взаимодействиям с PcG белками). Важным вопросом для будущих исследований является понимание, почему и как белки, такие как GAGA и Zeste, взаимодействуют с активирующими и репрессирующими аппаратами поддержания.

Как и любые факторы, влияющие на гистоны и активность генов, Polycomb и Trithorax могут быть причиной возникновения различных заболеваний, в основном онкологических.

В Medical College of Georgia Cancer Center под руководством Kapil Bhalla была проведена работа, в результате которой было выяснено, что гидроксамат-ингибиторы гистоновых деацетилаз LBH589 или LAQ824 вызывают снижение уровня EZH2, SUZ12 и EED, которые относятся к репрессорам белков Polycomb. EZH2, SUZ12 и EED обладают гистон-метилтрансферазной активностью, которая регулируется Su(var)3-9, энхансером zeste и trithorax-доменом EZH2. Они метилируют гистон H3 по лизину 27. Применение этих ингибиторов вызывает снижение уровня три- и диметилированных гистонов H3, что приводит к снижению клоногенного потенциала клеток в культуре миелоидного лейкоза (AML), а также LBH589-индуцированной дифференцировке клеток. Возможно это исследование послужит стимулом для разработки анти-EZH2 терапии  совместно с гидроксамат-ингибиторами гистоновых деацетилаз в качестве эпигенетической терапии онкологических заболеваний.

В настоящее время белки семейств Trithorax и Polycomb интенсивно исследуются. Несомненно, что они играют роль в возникновении онкологических заболеваний, например, лейкемии. Сейчас изучается их роль в возникновении старческой деменции, нейродегенеративных заболеваний, болезней геномного импринтинга, синдромы хромосомной нестабильности и др. Возможно, со временем на основе этих исследований будет разработано эпигенетическое лечение этих тяжелых, ныне неизлечимых заболеваний, многие из которых, как нейродегенеративные и онкологические, заболевания ассоциированы с возрастом.

28 сентября 2008 года