Оксидативное повреждение ДНК

В настоящее время свободные радикалы- одна из самых популярных тем для обсуждения, не только в научной общественности, но и в СМИ. Одна из теорий старения связана с оксидативным стрессом. Так что же это такое-свободные радикалы и оксидативный стресс?
Ядро атома окружено электронными орбиталями, каждая из которых содержит максимум по 2 электрона с разными спиновыми квантовыми числами. Атом водорода имеет одну внешнюю орбиталь, атомы азота, углерода и кислорода имеют по 4 внешние орбитали, захватывающие 8 электронов. Атомы более стабильны, когда орбитали заполнены электронами. Свободные радикалы -это высокоактивные молекулы или атомы, имеющие неспаренные электроны на внешней орбитали, которые не задействованы в образовании химической связи. Атомы или небольшие молекулы, являющиеся свободными радикалами, более нестабильны, чем большие, т.к. последние могут захватывать электрон для образования резонансной структуры (т.е. стабильную структуру).
Свободные радикалы могут повреждать нуклеиновые кислоты, белки и липиды. Для биологических систем наиболее важны кислородные свободные радикалы, в частности, супероксид- анион (superoxide (.O2−)), оксид азота (nitric oxide (.NO)) и гидроксильный радикал (hydroxyl radical (.OH)). Оксид азота относительно неактивный радикал, который живет всего несколько секунд, быстро реагируя с кислородом.  Но если он взаимодействует с супероксид- анионом, то образуестя пероксинитрит (peroxynitrite (ONOO−)), который разлагается с образованием гидроксильного радикала. Пероксинитрит, как и гидроксильный радикал, реагируют непосредственно с белками и другими макромолекулами с образованием альдегидов и кетонов, поперечных сшивок и продуктов перекисного окисления липидов. Только 1-4% однонитевых разрывов ДНК провоцируется пероксинитритом и гидроксильным радикалом. Кроме того, перекись водорода (hydrogen peroxide (H2O2)) и гипохлорит (hypochlorite (OCl-)) сами по себе не являются свободными радикалами,но эти кислород- содержащие молекулы могут облегчать образование свободных радикалов. Все эти кислород- содержащие молекулы объединены термином активные формы кислорода (АФК, ROS). АФК действуют на основания в составе нуклеиновых кислот, аминокислот боковых цепей белков и двойные связи в ненасыщенных жирных кислотах. 
Повреждение макромолекул (и клетки вцелом) в результате действия АФК называется оксидативным стрессом.

Около 95% от всего потребляемого кислорода клетки восстанавливается в митохондриях до воды в процессе окислительного фосфорилирования. Остальные 5% кислорода в результате различных реакций (как правило ферментативных) превращаются в АФК. Такое количество радикалов может нанести огромный вред клетке. Для нейтрализации АФК в клетке работает несколько ферментов: супероксиддисмутаза (SuperOxide Dismutase (SOD)), каталаза (catalase (CAT)) и глутатионпероксидаза (glutathione peroxidase), а также некторые низкомолекулярные антиоксиданты - витамин С, глутатион, мочевая кислота. Есть и другие антиоксиданты. Аминокислота метионин в эволюции накпливается в белках дыхательной цепи митохондрий, т.е. выступает в качестве естественного антиоксиданта. Для этого митохондрии даже несколько видоизменили свой генетический код (Bender et al, 2008). Кроме того, есть другой механизм приспособления- матки пчел и рабочие пчелы, характеризующиеся долгожительством по сравнению с самцами (трутнями) продуцируют в больших количествах предшественник желточного белка вителлогенин, который перехватывает свободные радикалы и таким образом, по-видимому, способствует их долгожительству (Seehus et al, 2005).
Супероксиддисмутаза катализирует реакцию между двумя супероксид- анионами, в результате которой образуются перекись водорода и триплетный кислород (кислород в основном состоянии).

Она является самым распростарненным антиоксидантным фактором в организме животных. Ее содержание в клетке зависит от метаболической активности.
Каталаза разлагает перекись водорода до воды и свободного кислорода. Каталазы локализуются в пероксисомах, в которых происходит деградация токсичных веществ (фенолов, муравьиной кислоты, формальдегида и этанола) с использованием перекиси.
Глутатион- пептид, состоящий из 3 аминокислот (цистеина, глицина и глутаминовой кислоты), который является главным антиоксидантом в нелипидных частях клетки (цитоплазме). Глутатион существует в двух формах- восстановленной (GSH) и окисленной (GSSG). Восстановленный глутатион отдает атом водорода, тем самым нейтрализуя гидроксил-радикал: GSH + .OH --> .GS + H2O. Молекулы окисленного глутатиона нейтрализуют друг друга: .GH + .GH --> GSSG Первую реакцию катализирует глутатионпероксидаза, вторую- глутатионредуктаза, которая использует NADPH в качестве источника водорода.
Сейчас идет интенсивная разработка различных методов воздействия на антиоксидантную систему и поиск новых антиоксидантов. Например, ученые из Университета Пенсильвании изобрели способ защиты трансплантированных легких от оксидативного стресса. Они связали антиоксидантный фермент (каталазу) с антителом. Этот комплекс взаимодействовал с эндотелиальными клетками, нейтрализуя АФК.

В чем заключается повреждающее действие свободных радикалов на ДНК?
В одно- и двунитевых разрывах,

образовании АП- сайтов ( т.е. потеря основания- пиримидина или пурина),

повреждении оснований и сахаров, входящих в состав ДНК.

Гидроксильный радикал вызывает ионизацию оснований ДНК. Кроме того, важную роль играют ненасыщенные жирные кислоты. После перекисного окисления они образуют стабильные производные, которые присоединяются к нуклеиновой кислоте, образуя ДНК- аддукты (соединения), считывание которых затруднено. Также образуются сшивки ДНК- ДНК и ДНК- белок. Как уже упоминалось, в процессе повреждения ДНК образуются модифицированные основания:
Агенты, повреждающие ДНК, также повреждают и РНК и свободные нуклеотиды. Пурины и пиримидины в 100-1000 раз более чувствительны к модификации в виде мононуклеозидов и нуклеотидов, чем в составе ДНК и РНК, где они защищены спиральной структурой. Модификация пула нуклеотидов- это один из важных факторов повреждения нуклеиновых кислот. Хотя ДНК- и РНК- полимеразы распознают поврежденные и модифицированные основания, это распознавание недостаточно и они могут встроить порежденные нуклеотиды в строящуюся нуклеиновую кислоту.

В клетках существует мощная система репарации, которая активируется в том числе и при оксидативном повреждении.
Согласно Olinski et al. репарация при оксидативной стрессе включает в себя прямую репарацию и эксцизионную.
Прямая репарация
Во всех клетках всех организмов есть фосфогидролазы- ферменты, которые гидролизуют трифосфаты поврежденных нуклеотидов до монофосфатов. Монофосфаткиназа распознает поврежденные и неповрежденные нуклеотиды и не позволяет поврежденным нуклеотидам рециркулировать в клеточном пуле нуклеозид-трифосфатов, вместо этого они дефосфорилируются нуклеазами и выводятся из клетки, что позволяет предотвратить их встраивание в ДНК ДНК- полимеразами.
Эксцизионная репарация (BER)
Главный механизм для удаления поврежденных оснований- эксцизионная репарация (Base Excision Repair, BER).

BER проходит в 5 этапов: 1) вырезание поврежденного основания специфическими ДНК- гликозилазами и формирование апуринового/апиримидинового (АП) сайта
2) разрыв фосфодиэфирной связи АП-сайта АП- эндонуклеазой или АП- лиазой
3) удаление химических групп, мешающих заполнению бреши и лигированию
4) заполнение бреши
5) лигирование (сшивка)

Промотор — последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая РНК-полимеразой как стартовая площадка для начала специфической, или осмысленной, транскрипции. У прокариот промотор включает ряд мотивов, важных для узнавания его РНК-полимеразой, в частности так называемые последовательности -10 и -35. Промотор асимметричен, что позволяет РНК-полимеразе начать транскрипцию в правильном направлении и указывает то, какая из двух цепей ДНК будет служить матрицей для синтеза РНК. Промоторный участок в пределах оперона может частично перекрываться или вовсе не перекрываться с операторным участком цистрона (гена). У эукариот, к которым относится и человек, нет оперонов, но транскрипция так же начинается с промотора. Кроме того, промоторы транскрипционно активных генов не защищены нуклеосомами, поэтому более подвержены окислению оснований. Также, промоторы богаты легко окисляемыми и трудно репарируемыми GC-последовательностями (при взаиммодействии с радикалами легко образуется 8 оксо-гуанин).
В связи с важностью промоторного участка, любая мутация в нем может привести к неправильному считыванию или невозможности транскрипции этого гена, что в свою очередь приводит к неправильному синтезу функционального белка. такой процесс может лежать в основе возникновения различных заболеваний.

Процесс оксидативного повреждения ДНК играет важную роль в возникновении различных возраст- ассоциированных заболеваний.

Онкологические заболевания
Рак- это генная болезнь. С этой точки зрения каждый фактор, взаимодействующий с ДНК и модифицирующий ее, является канцерогеном. Следовательно АФК обладают мутагенным, канцерогенным действием. Одним из самых изучаемых в настоящее время маркеров повреждения является 8-оксогуанин (8-oxoGua). Его присутствие в составе ДНК приводит к GC-TA замене, если не репарируется до репликации. Например, при исследовании уровня 8-оксогуанина в клетках миомы матки было выяснено, что этот уровень коррелирует с размером опухоли. Возрастающий уровень модифицированных оснований вызывает нестабильность генома и увеличивает потенциал метастазирования в сформировавшейся опухоли. Это было показано в исследованиях на некоторых видах аденокарциномы.
Оксидативным повреждением объясняется существование множества различных мутаций в одной клетке карциномы, с развитием опухоли число этих мутаций увеличивается. Разумно предположить, что они возникают в процессе развития опухоли. Здесь играют роль внутриклеточные процессы (окислительное фосфорилирование, метаболизм жирных кислот в пероксисомах, реакции с участием цитохрома P450, "респираторный взрыв" в фагоцитах), которые являются основным источником свободных радикалов, вызывающих изменение оснований, а следовательно и мутации, приводящие к возникновению рака.

Атеросклероз
Повреждения ДНК имеют важное значение в патогенезе атеросклероза. В некоторой степени атеросклеротическое повреждение тканей инициируется мутациями, так же как и при раке. Существуют данные, что в тканях аорты, пораженной атеросклеротическим процессом, обнаружен высокий уровень 8-оксогуанина, что может быть одной из причин заболевания.
Окисленный липопротеин низкой плотности (ЛПНП) также принимает участие в развитии атеросклеротического повреждения тканей. Было обнаружено, что, помимо своего основной функции- переноса холестерина, он (но не основная форма ЛПНП) снижает активность ферментов, принимающих участие в эксцизионной репарации 8-оксогуанина. Это же исследование показало, что витамин С совместно с α-токоферолом препятствуют этому процессу.

Нейродегенеративные заболевания
Возможно оксидативный стресс участвует в патогенезе болезни Альцгеймера. Эта теория основывается на том, что АФК вовлечены в нейротоксичность амилоидного бэта- протеина. Было показано, что пептиды спонтанно генерируют свободные радикалы. Высокий уровень 8-оксогуанина был обнаружен не только в лейкоцитах больных, но и в ткани мозга. Это значит, что снижение репарации ДНК играет роль в возникновении болезни Альцгеймера (у больных уровень OGG1 (8- оксогуанин-ДНК-гликозилаза) значительно ниже, чем у здоровых). Это в какой-то мере объясняет массовую гибель нейронов при этом тяжелом заболевании: накопление поломок ДНК в поврежденных нейронах служит сигналом для запуска апоптоза.

 

Роль оксидативного стресса в возникновении возраст-зависимых заболеваний до сих пор обсуждается. Сторонники "Свободнорадикальной теории старения" Хармана  считают, что накопление повреждений в результате оксидативного стресса приводит к возрастзависимому повреждению тканей, канцерогенезу и, наконец, к старению. Но находятся и противники этой теории. Как бы то ни было, во многом эта теория верна, но необходимы исследования:
1) как именно происходит повреждение,

2) как от него можно защитить клетку и организм вцелом,

3) как активизировать внутренние резервы,

4) как определить тот лимит, после которого возникает рак, диабет, атеросклероз и прочие спутники старения?
Эти и многие другие вопрос предстоит раскрыть ученым, и может быть тогда мы найдем эликсир молодости.

9 сентября 2008 года