Возрастзависимая модификация гистонов

Молекула ДНК огромна. Трудно себе представить, но в каждой клетке человеческого организма содержится ДНК длиной приблизительно 2м. Для того, чтобы уместить такое количество генетической информации необходима упаковка ДНК в хромосомы. Она осуществляется в том числе и с помощью гистонов.
Гистоны- это нуклеопротеины, основная составляющая хроматина. Известно 5 классов гистонов: H1, H2A, H2B, H3 и H4. Гистоны- эволюционно-консервативные белки, все они имеют структурный мотив "спираль поворот спираль поворот спираль" (трехспирального домена), что способствует их димеризации. Каждый из них имеет 2 аминокислотных "хвоста", которые являются мишенью для последующей эпигенетической модификации и регуляции.
 H2A, H2B, H3 и H4 формируют core- гистоновый октамер, структуру из 8 молекул гистонов (тетрамер (Н3)2-(Н4)2 и два димера Н2А-Н2В ), на которую наматывается ДНК. H1 (Linker histone) способствует правильному наматыванию ДНК на кор. Каждая нуклеосома состоит из H2A-H2B-димера и H3-H4-тетрамера. На одну нуклеосому (гистоновый октамер, обмотанный нитью ДНК) приходится 146 пар нуклеотидов ДНК, оплетающей нуклеосому в виде лево-закрученной спирали. В дальнейшем "бусы" из нуклеосом сворачиваются, в конце концов образуя хромосому.

Гистоны, образуя нуклеосому, вступают во взаимодействие с ДНК:
1) положительно заряженные спирали H2B, H3, и H4 взаимодействуют с отрицательно заряженными фосфатными группами молекулы ДНК
2) Водородные связи между остовом ДНК и амидными группами цепей гистонов
3) Неполярные связи между гистонами и дезоксирибозой ДНК
4) Водородные связи между боковыми цепями основных аминокислот гистонов (в основном лизина и аргинина) и кислородом фосфатных групп ДНК
5) Неспецифическое взаимодействие N-концевых "хвостов" H3 и H2B гистонов с малой бороздкой молекулы ДНК.

Взаимодействуя с ДНК, гистоны выполняют свои функции. Кроме рассмотренной выше структурной функции (участие в компактизации), гистоны участвуют в регуляции активности генов, репликации, репарации, рекомбинации ДНК. Гистоны подвергаются посттрансляционной модификации, что изменяет их взаимодействие с ДНК и ядерными белками. В основном модифицируются "хвосты", но могут модифицироваться и основные части белков (H2A и H3). Комбинация модификаций составляет "гистоновый код".
Как осуществляется регуляция активности генов? Рассмотрим схему:
В верхней части схемы- ДНК неметилирована, "хвосты" гистонов ацетилированы- это позволяет транскрипционным факторам и РНК-полимеразе "сесть" на нить ДНК и начать транскрипцию.
Средняя часть схемы- в результате действия метилтрансферазы ДНК метилируется (а следовательно не может транкрибироваться, т.к не может связаться с транскрипционными факторами). Это может активировать деацетилазу гистонов.
Нижняя часть схемы- метилирование ДНК и деацетилирование гистонов приводит к конденсации хроматина и невозможности связывания транскрипционных факторов.
Согласно Tony Kouzarides из Gurdon Institute гистоны интегрируют многие сигнальные пути различных биологических процессов, в том числе метаболизма ДНК. Разбалансировка процессов модификации гистонов наблюдается при старении и возрастассоциированных заболеваниях, в основном онкологических:

N- концевые "хвосты" гистонов содержат остатки аминокислоты лизина. Аминокислотная последовательность "хвостов", особенно местоположение остатков лизина, строго консервативна в эукариотических клетках, от дрожжей до человека. Лизин имеет положительно заряженную аминогруппу на эпсилон- атоме углерода (эпсилон- аминогруппа). Она ацетилируется гистоновой ацетилтрансферазой (HAT). Обратная реакция проходит под действием деацетилазы (HDA). Положительный заряд на амино- группе лизина взаимодействует с отрицательным зарядом фосфатных групп ДНК  и отрицательно- заряженными фрагментами гистонового октамера. Нейтрализация основного заряда гистоновых "хвостов" ацетилированием снижает их сродство с ДНК и меняет гистон- гистоновые взаимодействия между соседними нуклеосомами, а также взаимодействия гистонов с др. регуляторными белками. Это делает возможной транскрипцию.

Активные гены обычно локализованы в гиперацетилированном хроматине, неактивные- в гипоацетилироанном. Транскрипционные факторы, активирующие транскрипцию, активируют HAT, факторы, ингибирующие (подабляющие) транскрипцию, активируют HDA.

При онкологических заболеваниях и некоторых вирусных инфекциях нарушается свойственный нормальной клетке баланс между ацетилированием и деацетилированием гистонов. Так, аденовирусный онкобелок Е1А ингибирует активность гистоновой ацетилтрансферазы, и, следовательно, гистоны остаются без ацетильной метки. В результате невозможно действие деацетилазы, а ведь от ее взаимодействия с определенным белком зависит подавление роста клеток раковой опухоли. Еще один пример касается ретинобластомного белка (RB), который в норме синтезируется в сетчатке и многих других тканях. Если ген этого белка поврежден, образуется измененный RB, неспособный связываться с транскрипционным комплексом, а тот, будучи без RB, не может взаимодействовать с гистоновой деацетилазой. В результате молчащие в нормальной клетке гены начинают работать, что и приводит к развитию онкологических заболеваний. Такой ход событий выявлен при многих раковых заболеваниях. Более того, некоторые вирусные онкобелки способны целенаправленно блокировать взаимодействие нормального ретинобластомного белка с гистоновой деацетилазой.
В проблеме связи ацетилирования/деацетилирования гистонов и старения существует много неясного. Известно, что с возрастом снижается уровень ацетилирования гистонов, в частности H4 гистона. Также выявлено, что от уровня ацетилирования гистонов зависит уровень активности генов супероксиддисмутазы, а следовательно, и защита клетки от оксидативного стресса, который, согласно некоторым теориям, и является фактором старения. Все эти вопросы требуют детального изучения.

Фосфорилирование гистонов осуществляется по сериновым остаткам. Фосфорилирование серина 10 гистона H3 коррелирует с активацией генов в клетках млекопитающих и с индукцией транскрипции во время шоковой реакции у Drosophila. Покоящиеся фибробласты, обработанные фактором роста эпидермиса, быстро фосфорилируются по серину 10, что совпадает с индукцией раннего ответа генов, таких как c-fos. Это фосфорилирование катализируется с помощью Rsk-2-киназы, а клетки от пациентов с Rsk-2-дефицитом (Coffin-Lowry Syndrome) не подвергаются фосфорилированию по серину 10 или индукции c-fos в ответ на фактор роста эпидермиса.
Добавление негативно заряженных фосфатных групп в хвосты гистонов нейтрализует их базовый заряд и снижает их сродство к ДНК. Более того, некоторые ацетилтрансферазы обладают повышенной HAT- активностью на серин 10-фосфорилированном субстрате, а мутации серина 10 снижают активацию регулируемых Gcn5 генов (генов ацетилтрасферазы HAT). Таким образом, фосфорилирование может участвовать в активации транскрипции, стимулируя HAT активность того же самого гистонового "хвоста". Так, фосфоацетилирование гистона H3 влияет на процесс активации транскрипционных факторов c-fos- и c-jun, модифицируя тем самым экспрессию различных генов.
Фосфорилирование H2A коррелирует с конденсацией митотических хромосом. Мутация серина 10 в гистонах Tetrahymena обусловливает аномальную конденсацию хромосом и неправильное разделение хромосом в анафазе митоза.
Фосфорилирование H3 происходит после активации сигнального пути в ответ на повреждение ДНК. Например, эволюционно консервативный мотив (ASQE, in the single-letter amino-acid code) , обнаруживаемый на С-конце дрожжевого H2A и варианта H2A млекопитающих, H2A.X , быстро фосфорилируется в ответ на действие ДНК-повреждающего агента. Идентифицирован серин 139 как место для такой модификации, его фосфорилирование в ответ на повреждение зависит от фосфатидилинозитол-3-OH киназы Mec1 у дрожжей. Mec1-зависимое фосфорилирование серина 139, по-видимому, необходимо для эффективной негомологичной репарации ДНК.

Сейчас широко изучается роль модификации гистонов в развитии онкологических заболеваний и процессе старения. В частности, этой проблемой занимается Питер Адамс из Fox Chase Cancer Center. Выяснено, что существуют участки хроматина, ассоциированные с клеточным старением (senescence associated heterochromatin foci, SAHF). Они представляют собой возрастассоциированные очаги транскрипционно- неактивного гетерохроматина, содержащего
гены-мишени пролиферативного транскрипционного фактор E2F.  Предполагается, что образование транскрипционно- неактивного гетерохроматина в местах локализации генов, ответственных за пролиферацию, приводит к необратимой остановке клеточного цикла, характеризующей процесс старения. Возможно это связано с фосфорилированием гистонов, например фосфорилирование серина 93 в H1 гистоне.

Известно, что интенсивность метилирования гистонов меняется в течении клеточного цикла. Метилирование гистонов наблюдается во время перехода клеток из S в G2 - фазу. В период митоза происходит также метилирование богатых аргинином гистонов, что свидетельствует о наличии корреляции между метилированием белков хроматина и скоростью роста клеток. При этом необходимо подчеркнуть, что метилтрансферазы зрелых, эмбриональных и неопластических тканей имеют различную активность. Эти данные являются подтверждением того, что метилирование принимает участие в процессах дифференциации клеток, а метилирование белков хроматина является одним из параметров, которые характеризуют функциональное состояние клетки.
Модификации гистонов могут служить как cis-действующие связывающие места для вспомогательных факторов, таких как гетерохроматиновый белок 1, который связывается с гистоном H3 за счет метилирования по остатку лизина 9, что является основным биомолекулярным взаимодействием в гетерохроматине и контролируется Suv39h1 и Suv39h2 гистоновой метилтрансферазой. Метилирование гистонов также происходит в гистоне H3 в позиции лизина 4, но в этом случае метилирование коррелирует с транскрипционной активностью. Сама ДНК может метилироваться в основном по остаткам цитозина в CpG динуклеотидах. Здесь также метилирование способствует биомолекулярным взаимодействиям между гетрохроматином и вспомогательными белками, такими, как MeCP2, and MBD1, 2 и 3 (Писаржевский). Таким образом, метилирование лизина 9 в гистоне-3 и метилирование ДНК взаимозависимы. Иными словами, СН3-модификация ДНК определяется ее эпигенетическим выключением (т.е. метилированием гистоновых “хвостов”) в составе хроматина (Карпов, 2005). Выключение генов, продукты которых подавляют раковые опухоли, и активация генов, необходимых для их роста, происходят одновременно. Расшифровка специфического эпигенетического “ракового кода” и “кода старения” на уровне метилирования ДНК имеет огромное практическое значение и уже сейчас может использоваться для диагностики онкологических заболеваний. Более того, правильно подобрав препараты, в идеале можно изменить “раковый код” и вернуть клетку к нормальному состоянию.

Для того, чтобы решить эти задачи, необходимо точно определить сайты метилирования и соответствующие им метилтрансферазы, механизмы функционирования метилтрансфераз.

Убиквитинирование- присоединение к белку небольшого белка убиквитина с помощью убиквитин-лигаз, осуществляется посттрансляционно для инициирования деградации, а также для регуляции локализации и функционирования белка. Потеря сайтов убиквитинирования приводит к дефектам мейоза и митоза.

Убиквитинирование H2A и H2B гистонов имеет важнейшее значение для внутриклеточных процессов- инициации и элонгации транскрипции, инактивации генов и репарации ДНК. Кроме того, убиквитинирование гистонов влияет и на другие их модификации:

Гистон H2B убиквитинируется с помощью Rad6 по лизину 123. Убиквитинирование гистонов служит сигналом для фактора COMPASS, который метилирует гистон H3 по лизину 4. В результате инактивируются располагающиеся рядом гены.
Кроме того, моноубиквитинирование H2A может останавливать элонгацию транскрипции с помощью ингибирования РНК-полимеразы II, а деубиквитинирование активирует транскрипцию.
Несомненно, что между процессами убиквитинирования гистонов и процессами старения и канцерогенеза есть связь, но этот вопрос еще малоизучен. Убиквитинирование так или иначе влияет на все этапы экспрессии генов, а значит его нарушение может приводить к патологическим изменениям в функционировании клетки, к раковому перерождению, старению. Необходимы исследования в этой области, т.к. механизмы этого процесса, его регуляции и возможные его изменения неизучены.
 

Сумоилирование схоже с убиквитинированием, оно представляет собой присоединение небольших убиквитин-подобных белков (Small Ubiquitin-like Modifier -SUMO). Также, как и убиквитинирование, сумоилирование важно для многих внутриклеточных процессов- внутриклеточном транспорте, регуляции транскрипции, апоптозе, ответе на стресс и прохождении клеточного цикла. В отличие от убиквитина, SUMO не направляют белок на деградацию.
Сейчас исследуется связь между сумоилированием гистонов и канцерогенезом, обсуждаются перспективы создания лекарств против рака, эффект которых основывается на воздействии на системы модификации гистонов, в том числе сумоилироание.
В лаборатории под руководством Филипа Брантона в McGill University,Montréal проводятся исследования связи сумоилирования гистонов с процессами старения и канцерогенеза. Было выяснено, что RBP1 (белок, ассоциированный с ретинобластомой) подавляет транскрипцию и клеточный рост (процессы, схожие со старением) , изменяя сумоилирование гистонов.

Модификации гистонов играют огромную роль в регуляции экспрессии генов, а следовательно, во всех внутриклеточных процессах. При нарушении процессов модификации изменяется экспрессия генов, что ведет за собой развитие различных заболеваний и старение. Эти вопросы еще недостаточно исследованы. внимание основной части ученых сконцентрировано на ацетилировании гистонов, тогда как другие, не менее важные процессы, вниманием обделены. Перспективы исследований огромны, потому что 21 век-это не столько век генетики, а век эпигенетики- изучения регуляции экспрессии генов. Возможно в будущем будут созданы лекарства от рака, мишенью которых будут ферменты, модифицирующие гистоны. Пора переходить от слов к действиям...Есть несколько вопросов, на которые необходимо ответить:
1) Как повлиять на ацетилирование гистонов для защиты от оксидативного стресса и старения?

2) Как повлиять на ацетилирование гистонов для борьбы с онкологическими заболеваниями?

3) Каков точный механизм участия фосфорилирования гистонов в возникновении онкологических заболеваний и старении?

4) Расшифровка специфического "ракового кода" и "кода старения" на уровне метилирования гистонов.

5) Подробности механизма убиквитинирования гистонов.

6) Как именно убиквитинирование связано с онкологическими и возрастассоциированными заболеваниями?

7) Как убиквитинирование гистонов участвует в процессе старения?

8) Как происходит сумоилирование гистонов?

9) Как сумоилирование связано с процессом старения?

10) Какова роль сумоилирования в возникновении онкологических заболеваний?

11) Как можно повлиять на механизмы модификации гистонов с целью достижения терапевтического эффекта при лечении возрастассоциированных заболеваний?
Ответы на эти вопросы необходимы для победы над старением.

16 сентября 2008 года