Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки - вид плюрипотентных стволовых клеток, искусственно полученных из неплюрипотентных клеток, обычно из взрослых соматических клеток, путем "вынужденной" индукции (процесс запуска транскрипции гена или белка вследствие действия определенного фактора-индуктора) определенных генов. Этот процесс осуществляется путем трансфекции (процесс переноса генетического материала в клутку с помощью вирусных векторов) определенных генов стволовых клеток в неплюрипотентную клетку человека, такую как фибробласт, с помощью вирусных векторов (ретровирусов).

Схема получения индуцированных плюлрипотентных клеток.
(1) - изолирование и культивирование донорных клеток
(2) - трансфекция ассоциированных со стволовой клеткой генов в донорные клетки с помощью вирусных векторов. Красные клетки - те, в которых происходит экспрессия экзогенных генов.
(3) - сбор и культивирование клеток соответственно культуре эмбриональных стволовых клеток, используя митотически неактивированные фидерные клетки (светло-серые, клетки, используемые в культуре для опоры и питания ПСК, фидерные клетки обработаны таким образом, чтобы они не делились)
(4) - небольшое количество клеток становятся iPS-клетками (Induced Pluripotent Stem Cells) и генерируют подобные эмбриональным колонии стволовых клеток.

Считают, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS-клетки) идентичны натуральным плюрипотентным стволовым клеткам, таким как эмбриональные стволовые клетки (стволовые клетки, полученные из внутренней клеточной массы бластоцисты - эмбриона на ранней стадии развития), по многим показателям, таким как экспрессия определенных генов и белков стволовых клеток, места (паттерны) метилирования хроматина, время удвоения, формирование эмбриоидных тел (агрегаты эмбриональных стволовых клеток, образующиеся после помещения этих клеток в культуру), формирование тератомы (опухоли из клеток всех трех эмбриональных слоев), формирование жизнеспособных химер (животных, состоящих из клеточных клонов двух разных типов: клеток исходного родительского генотипа и iPS-клеткок) и способность дифференцироваться, однако в полной мере их идентичность с натуральными плюрипотентными стволовыми клетками все еще оценивается.

Впервые iPS-клетки были синтезированы их клеток мыши в 2006 году, а из клеток человека - в 2007. Это открытие является прорывом в исследовании стволовых клеток, так как оно позволяет получать плюрипотентные стволовые клетки без использования эмбрионов.

Стволовые клетки имеют 2 важные характеристики, которые отличают их от других клеток. Во-первых, они являются неспециализированными клетками, которые возобновляют сами себя в течение долгого времени путем клеточного деления. Во-вторых, при определенных физиологических или экспериментальных условиях они могут быть индуцированы для превращения в клетки со специальными функциями, такие как клетки сердечной мышцы или инсулин-синтезирующие клетки поджелудочной железы.
Стволовые клетки различаются своей потентностью - спектром возможных направлений дифференцировки.
1. Тотипотентные стволовые клетки получают из слияния яйцеклетки и сперматозоида. Клетки, полученные в результате нескольких первых делений оплодотворенной яйцеклетки также являются тотипотентными. Эти клетки могут диференцироваться в эмбриональные и экстраэмбриональные (например, клетки плаценты) типы клеток.
2. Плюрипотентные клетки происходят от тотипотентных клеток и могут дифференцироваться в любой из трех зародышевых слоев (эндодерма, мезодерма, эктодерма).
3. Мультипотентные стволовые клетки могут производить лишь клетки из близких семейств (например, гематопоэтические стволовые клетки дифференцируются только в красные клетки крови, белые клетки крови, тромбоциты и т.д.)
4. Унипотентные клетки производят только один тип клеток, но имеют свойство само возобновления, что и отличает их от не-стволовых клеток (например, мышешные стволовые клетки).

Методы перепрограммирования стволовых клеток.

Основной метод перепрограммирования для получения iPS-клеток - использование вирусных векторов - чужеродная ДНК (вируса или бактериофага) включается в генетический аппарат клетки и с помощью её обменных механизмов начинает синтезировать «свой» белок.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки впервые были получены командой Шинья Яманака (Shinya Yamanaka) в Университете Киото, Япония в 2006 году. Яманака определил гены, которые особенно активны в эмбриональных стволовых клетках, и использовала ретровирусы для трансфекции некоторых из этих генов в фибробласт мыши. Таким образом, были выделены 4 ключевых гена плюрипотентности: Oct-3/4, SOX2, c-Myc, и Klf4. Однако эти линии iPS-клеток демонстрировали ошибки при метилировании ДНК при сравнении с местами, где это происходит в обычных эмбриональных стволовых клетках. Также не удалось получить жизнеспособные химерные организмы при введении этих iPS-клеток в развивающиеся эмбрионы.

Kazutoshi Takahashi and Shinya Yamanaka "Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors"

В июне 2007 группа Яманака опубликовала статью, наряду еще с двумя другими независимыми группами ученых из Гарварда, MIT (Рудольф Джениш, Мариус Верниг)(Rudolf Jaenisch, Marius Wernig) и Университета Калифорнии, Лос Анжесес (Джеймс Томсон, James Thomson), в которой было описано успешное перепрограммирование мышиного фибробласта в iPS-клетку а также получение жизнеспособной химерной мыши. Эти клеточные линии были также получены с помощью вирусного внедрения в ДНК тех же четырех плюрипотентных факторов, но на этот раз ученые выбрали другой маркер для детектирования. Вместо Fbx15 они использовали Nanog, который является важным геном в эмбриональных стволовых клетках. Места метилирования ДНК и получение жизнеспособных химер показали, что Nanog - основной определяющий плюрипотентность фактор.

К сожалению, один из четырех использованных генов (c-Myc) онкогенный, и у 20% химерных мышей развился рак. Как сообщает Scientific American, Яманака показал, что возможно создание iPS-клеток и без использования c-Myc. Процесс занимает больше времени, и его производительность ниже, но у полученных химер не развился рак. Это подтверждает и Мариус Верниг в своей статье c-Myc Is Dispensable for Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts, Marius Wernig, Alexander Meissner, John P. Cassady and Rudolf Jaenisch

Marius Wernig, Alexander Meissner, Ruth Foreman, Tobias Brambrink, Manching Ku, Konrad Hochedlinger, Bradley E. Bernstein, Rudolf Jaenisch In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state

Keisuke Okita, Tomoko Ichisak, Shinya Yamanaka Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells

Доклад Мариуса Вернига на конфенеции SENS3 в Кэмбридже

Мыши, больные человеческой серповидноклеточной анемией были вылечены с помощью репрограммированных клеток своей кожи. Как сообщает Science Express online от 6 декабря 2007, исследование было проведено в лаборатории профессора Whitehead Рудольфа Джениша.

Это первое подтверждение принципа терапевтического применения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

В ноябре 2007 года было опубликовано важнейшее достижение - были получены ИПСК из взрослой клетки человека. На эту тему были опубликованы 2 независимые статьи - одна в журнале Science авторы Джеймс Томпсон с коллегами из Университета Висконсин-Мэдиссон, а другая - в жернале Cell Шинья Яманака и коллеги, Университет Киото. Пользуясь теми же самыми принципами, что и мышиных моделях, Яманака успешно трансформировал фибробласт человека в плюрипотентную клетку, используя те же самые четыре гена: Oct3/4, Sox2, Klf4, и c-Myc с ретровирусной системой. Томсон и коллеги использовали OCT4, SOX2, NANOG и LIN28, используя лентивирусную систему.

Используемые системы вирусной трансфекции встраивают гены в случайном месте в геном клетки хозяина; это является вопросом, который необходимо решить для клинического применения iPS-клеток, так как полученные клетки могут оказаться подверженными раковым заболеваниям. Поэтому члены обоих исследовательских групп считают необходимым найти другой способ введения генов в клетку.

Kazutoshi Takahashi, Koji Tanabe, Mari Ohnuki, Megumi Narita,Tomoko Ichisaka, Kiichiro Tomoda, Shinya Yamanaka "Induction of Pluripotent Stm Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors"

Ключевые гены для индукции генерации iPS-клеток.

Oct-3/4 и определенные члены семейства Sox генов (Sox1, Sox2, Sox3, and Sox15) являются ключевыми регуляторами транскрипции, вовлеченными в процесс индукции. Без этих генов индукция невозможна. Однако определили, что некоторые гены, включая членов семейства Klf (Klf1, Klf2, Klf4, и Klf5), семейства Myc (C-myc, L-myc, and N-myc), Nanog, и LIN28 увеличивают эффективность индукции.

* Oct-3/4 (Pou5f1): Oct-3/4 - один из членов семейства октамерных ("Oct") факторов транскрипции, играет ключевую роль в поддержании плюрипотентности. Отсутствие Oct-3/4 в Oct-3/4+ клетках, таких как бластомеры и эмбриональные стволовые клетки, приводит к спонтанному дифференцированию трофобласт (клетки наружного клеточного слоя бластоцисты млекопитающих, через который проходят питательные вещества от материнского организма), таким образом, присутствие Oct-3/4 повышает плюрипотентность и потенциал для дифференцирования эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Различные другие гены из семейства "Oct", включая ближайших родственников Oct-3/4, включая Oct1 и Oct6, не вызывают индукцию, что говорит о уникальности генов Oct-3/4 для процесса индукции.

* Семейство Sox: Семейство генов Sox, как и Oct-3/4, связано с поддержанием плюрипотентности, однако оно связано с мультипотентными и унипотентными стволовыми клетками, в отличие от Oct-3/4, которые экспрессируются только лишь в плюрипотентных клетках. Изначально Яманака и др., Джениш и др. и Томпсон и др. использовали Sox2 в качестве гена индукции, было обнаружено, что на процесс индукции влияют и другие гены. Sox1 дает ИПСК приблизительно с той же эффективностью, что Sox2, а гены Sox3, Sox15 и Sox18 также производят iPS-клетки, но с меньшей эффективностью.

* Семейство Klf: в качестве фактора генерации мышиных ИПСК, Klf4 был впервые объявлен группой Яманака и подтвержден группой Джениша. Яманака продемонсрировал, что он является фактором генерации ИПСК человека. Было также определено, что Klf2 и Klf4 способны продуцировать ИПСК, Klf1 и Klf5 тоже, однако не с такой эффективностью.

* Семейство Myc: Семейство генов Myc - прото-онкогены, влекущие за собой рак. Команды Яманака и Джениша показали, что c-Myc является фактором генерации iPS-клеток мышей, и Яманака продемонстрировал, что это фактор синтеза iPS-клеток человека. Однако команды Томпсона и Яманака и неопубликованная работа из Института Джона Хопкинса сообщили, что c-Myc является необязательным для синтеза iPS-клеток. Использование c-Myc в клинической терапии нежелательно, так как 25% мышей, которым пересадили индуцированные с помощью c-Myc ПСК, развили смертельные тератомы.

* Nanog: в ЭСК Nanog, наряду с Oct-3/4 and Sox2 необходим для промотирования плюрипотентности. Использование Nanog в качестве одного из факторов привело к созданию линий iPS-клеток второго поколения, которые дают возможность получать жизнеспособные химерные организмы.

* LIN28: LIN28 является mRNA-связывающим белком, экспрессирующимся в ЭСК и эмбриональных клетках карциномы, ассоциированный с дифференциацией и пролиферацией. Томпсон и др. показал, что он является фактором синтеза iPS-клеток, однако он необязательный.

Полностью дифференцированные В-клетки могут быть перепрограммированы в состояние, близкое к эмбриональным стволовым клеткам без использования яйцеклеток.
Ранее сообщалось о создании индуцированных плюрипотентных клеток из фибробластов. Однако фибробласты являются не полностью дифференцированными клетками, и, следовательно, их легче конвертировать в IPS-клетки.

В-клетки – клетки иммунной системы, связывающиеся со специфическими антигенами, такими как белки бактерий, вирусов или микроорганизмов. В отличие от фибробластов, в геноме В-клеток имеются специфические участки ДНК, которые вырезаются при терминальной дифференцировке. «Раз участки ДНК были вырезаны, их невозможно вернуть назад, - рассказал Джейкоб Ханна (Jacob Hanna, Whitehead Institute of Biomedical Research), ведущий автор исследования, - поэтому, анализируя геном, мы можем быть уверены, что IPS-клетки получены именно из дифференцированных клеток».

Jacob Hanna и его коллеги начали свои эксперименты с создания IPS-клеток из незрелых В-клеток. С помощью методики, используемой для репрограммирования фибробластов, исследователи репрограммировали незрелые В-клетки, трансфецируя их ретровирусами, содержащими четыре гена (Oct4, Sox2, c-Myc и Klf4).

Чтобы подтолкнуть репрограммирование зрелых В-клеток необходим еще один фактор CCAAT/enhancer-binding-protein-a (C/EBPa).

Полученные из зрелых и незрелых В-клеток IPS-клетки, также как и репрограммированные фибробласты, могут быть использованы для создания мышей. В геноме мышей, полученных из репрограммированных зрелых В-клеток, отсутствуют те же фрагменты ДНК, что и в геноме зрелых В-лимфоцитов. Этот факт доказывает, что исследователям удалось успешно репрограммировать терминально дифференцированные клетки.

Представленная работа открывает перспективы создания новых мышиных моделей аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз и диабет I типа, при которых клетки иммунной системы атакуют клетки своего же организма. Например, дифференцированные В- или Т-клетки, специфичные для нервной ткани (глии), могут быть репрограммированы в IPS-клетки. Затем из них могут быть получены мыши, иммунная система которых будет нацелена исключительно на атаку глиальных клеток, и такие животные смогут служить экспериментальной моделью рассеянного склероза.Эта болезнь поражает молодых людей от 16 до 35 лет, находящихся в расцвете творческих сил и возможностей, и превращает их в инвалидов. С ней просто необходимо бороться.

По мнению исследователей, подобная методика в будущем позволит переносить сложные генетические заболевания человека в чашки Петри для последующего изучения и поиска терапии. Все это позволит человеку еще ближе подойти к решению глобальной проблемы старения.

Источник:. Jacob Hanna, Styliani Markoulaki, Patrick Schorderet,
Caroline Beard, Bryce W. Carey, Marius Wernig, Menno P. Creyghton,
Eveline J. Steine, John P. Cassady, Christopher J. Lengner, Jessica A.
Dausman, Rudolf Jaenisch. 2008. Direct reprogramming of terminally
differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell. 134 (2).

Японские ученые из Университета Киото (группа Яманака) перепрограммировали мышиные гепатоциты (клетки печени) и эпителиальные клетки желудка. Развитие опухоли, содержащей все типы клеток эмбриональных листков, и экспрессия генов, ассоциированных со стволовыми клетками, доказывает, что получены новые виды индуцированных плюрипотентных клеток. Обратная полимеразная цепная реакция показала, что iPS-клетки печени и желудка экспрессируют сравнимые с эмбриональными стволовыми клетками количнства эндогенных (внутреннего происхождения) Oct3/4 и Sox2.

Ученые использовали тот же набор генов (Oct 3/4, Sox2, Klf4 и c-Myc), однако, когда c-Myc был исключен, эффективность индуцирования понизилась совсем не так драматично, как в случае фибробластов. Также было показано, что место встраивания в ДНК генов, которые несут ретровирусные векторы, не имеет принципиального значения.

Получение iPS-клеток из гепатоцитов и эпителия желудка является шагом вперед в получении индуцированных плюрипотентных клеток, так как количество случаев возникновения опухолей у мышей, которым вводились эти клетки, заметно уменьшилось (сначала сообщалось об отсутствии случаев развития рака, однако, впоследствии эти данные были скорректированы). Это говорит о том, что со временем будут получены пациент-специфичные iPS-клетки, которые будут использоваться в терапевтических целях для восстановления поврежденных тканей, и они не будут вызывать рак у пациента. Все это приблизит человека еще на шаг к победе над самой разрушительной болезнью - старением.

Aoi T, Yae K, Nakagawa M, Ichisaka T, Okita K, Takahashi K, Chiba T, Yamanaka S Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells

Для возможной терапии различных заболеваний с помощью iPS-клеток, необходимо решить несколько проблем, включающих избавление от рисков и недостатков существующего ныне метода генетического преобразования клеток и низкой эффективности и медленной кинетики индукции. Авторы статьи A Combined Chemical and Genetic Approach for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells (смю ниже) выяснили, что нервные прогениторные клетки (НПК - клетки предшественники, близки к стволовым) могут быть перепрограммированы с помощью меньшего числа генетических манипуляций по сравнению с ранее использованными соматическими клетками, а также что маленькие молекулы могут заменить вирусное взаимодействие определенных факторов транскрипции и способствовать процессу пеерпрограммирования.
НПК, которые экспрессируют Sox2 эндогенно, были перепрограммированы после трансфекции только лишь Oct3/4 и Klf4, и из них получили колонии iPS-клеток.

Было обнаружено, что малая молекула BIX-01294, ингибитор G9a гистон метилтрансферазы (Kubicek, S., O’Sullivan, R.J., August, E.M., Hickey, E.R., Zhang, Q., Teodoro, M.L., Rea, S., Mechtler, K., Kowalski, J.A., Homon, C.A., et al. (2007). Mol. Cell 25, 473–481), может увеличить эффективность перепрограммирования НПК, трансфецированных только Oct3/4-Klf4, до уровня, сравнимого с трансфекцией всех четырех факторов.

Из результатов, представленных Yan Shi можно сделать следующие выводы: уровни эндогенной экспрессии генов, необходимых для репрограммирования некоторых ткане-специфичных соматических клеток могут быть достаточными для замены вирусной трансдукции экзогенных генов и получения iPS-клеток. Однако в работе использовались НПК зародыша, взрослые клетки могут не обладать такой способностью.
Использование малых молекул может снизить вероятность возникновения раковых опухолей и обеспечить эффективное и безопасное перепрограммирование.

Marson (группа Рудольфа Джениша) показал в своей статье, что растворимый Wnt3a способствует перепрограммированию iPS-клеток в отсутствие c-Myc ретровируса. Эти данные демонстрируют, что сигнальные пути трансдукции и транскрипционные факторы могут работать заодно при перепрограммировании дифференцированных клеток в плюрипотентное состояние.
Сигнальный путь Wnt вносит вклад в поддержание плюрипотентности в эмбриональных стволовых клетках мыши и человека (Sato et al., 2004; Ogawa et al., 2006; Singla
et al., 2006; Cai et al., 2007)

Весьма вероятно, что Wnt или малые молекулы, которые регулируют сигналлинг Wnt, окажутся весьма полезными, наряду с другими временными сигналами, которые еще предстоит определить, для полного избавления от оставшихся ретровирусов.

Влияние неспецифических ингибиторов ДНК-метилтрансферазы и гистоновой
деацетилазы на эффективность репрограммирования эмбриональных
фибробластов мышей.

Успешная индукция iPS клеток из нейральных стволовых клеток с помощью комбинации двух факторов.

Дальнейшие открытия химических веществ и малых молекул, которые способствуют эпигенетическому перепрограммированию, в сочетании с усиленной активацией эндогенных генов перепрограммирования, могут претворить в жизнь генерацию iPS-клеток без ретровирусного вмешательства. Это сделает возможным безопасное создание человеческих iPS-клеток для применения в клинической терапии, что сделает возможным избавление от старения и других болезней.

Yan Shi, Jeong Tae Do, Caroline Desponts, Heung Sik Hahm, Hans R. Scho¨ ler, and Sheng Ding "A Combined Chemical and Genetic Approach for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells"

Alexander Marson, Ruth Foreman,Brett Chevalier, Steve Bilodeau, Michael Kahn, Richard A. Young and Rudolf Jaenisch "Wnt Signaling Promotes Reprogramming of Somatic Cells to Pluripotency"

Takashi Tada "Genetic Modification-free Reprogramming to Induced Pluripotent Cells: Fantasy or Reality?"

Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из дифференцированных клеток человека является одним из важнейших прорывов в области изучения и применения стволовых клеток.
Этот подход дает возможность использовать собственные ткани пациента и, таким образом, решает проблему отторжения пересаженных тканей, избавляя от необходимости принимать иммунодепрессанты. Это значит, что в скором времени можно будет заменить поврежденную или пораженную ткань человека на точно такую же ткань этого пациента, только здоровую. Это решит проблему терапии множества болезней.

Авторы недавней статьи John T. Dimos, Kit T. Rodolfa, Kathy K. Niakan, Laurin M. Weisenthal, Hiroshi Mitsumoto, Wendy Chung, Gist F. Croft, Genevieve Saphier, Rudy Leibel, Robin Goland, Hynek Wichterle, Christopher E. Henderson, Kevin Eggan "Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons" получили iPS-клетки из фибробластов 82-летней женщины, больной наследственной формой бокового амиотрофического склероза (болезнь Шарко). Эти пациент-специфичные клетки были успешно перепрограммированы в моторные нейроны - тип клеток, разрушающийся при этим заболевании.

После преодоления возникновения новообразований при использовании iPS-клеточной терапии у людей, больных неизлечимыми заболеваниями, такими как болезнь Шарко, появится возможность преодолеть заболевание и продолжать жить здоровыми.

А самое главное - у человека появился реальный шанс избавиться от старения. При должном уровне диагностики будет не сложно выявлять возрастные нарушения работы органов и уже на самом начальном этапе исправлять эти нарушения с помощью клеточной терапии. Таким образом, можно поддерживать организм в "молодом" состоянии на протяжении очень длительного времени, что фактически отменияет старение.