Интроны. Генетический мусор или нечто большее?

В ходе различных исследований было выяснено, что большинство генов эукариот оказалось разорванными (split) на несколько кодирующих участков (экзонов), разделенных находящимися между ними некодирующими последовательностями - интронами. Оказалось, что внутри генов эукариот всегда бывают участки, которые не кодируют ни полипептидов, ни стабильных РНК. Эти участки назвали интронами — от английских слов intervening zone — зона, „перемежающая“ смысловую последовательность гена. А кодирующие участки были названы экзонами (от expressing zone — экспрессируемая зона гена). Во многих случаях каждому экзону соответствует домен — часть белковой молекулы, обладающая относительной завершённостью и независимостью.

Интрон — участок ДНК, который является частью гена, но не содержит информации о последовательности аминокислот белка. Иными словами, это транскрибируемый участок ДНК, который удаляется из состава транскипта при сплайсинге; в результате последовательности, находящиеся по обе стороны от интрона (экзоны) объединяются. Последовательность нуклеотидов, соответствующая интрону, удаляется из транскрибированной с него мРНК в процессе сплайсинга до того, как произойдет считывание белка (трансляция).


Интроны характерны для всех типов эукариотической РНК, но также найдены в рибосомальной РНК (рРНК) и транспортной РНК (тРНК) прокариот. Число и длина интронов очень различны в разных видах и среди разных генов одного организма.  Гены млекопитающих, в том числе человека, и цветковых растений часто содержат многочисленные интроны, которые могут быть длиннее экзонов. Кодирующие последовательности, которые в конечном итоге и дают мРНК, показаны черным, а интроны - белым:
Число интронов достигает иногда поразительно высоких значений, если учесть точность процессинга, необходимого для продуцирования функциональной мРНК: 33 интрона для гена вителлогенина A (Wahli et al.) и даже 50 интронов для коллагенового гена (de Crombrugghe et al.).

Существует четыре группы интронов:
Ядерные интроны
Интроны группы I
Интроны группы II
Интроны группы III

Иногда интроны группы III также относят к группе II, потому что они похожи по структуре и функции.

Ядерные, или спалайсосомные интроны подвергаются сплайсингу при помощи сплайсосомы и малых ядерных РНК (мяРНК, snRNA). В последовательности РНК, содержащей ядерные интроны, есть специальные сигнальные последовательности, которые узнаются сплайсосомой.

Интроны I, II и III группы способны к автосплайсингу и встречаются реже, чем сплайсосомные интроны. На рисунке представлена схема кристаллической структуры автосплайсинга интрона группы I (экзон обозначен красным). Интроны II и III группы похожи друг на друга и обладают консервативной вторичной структурой. Они обладают свойствами, похожими на свойства сплайсосомы и, вероятно, являются её эволюционными предшественниками. Интроны I группы, которые встречаюся у бактерий и простейших — единственный класс интронов, который требует присутствие несвязанного гуанилового нуклеотида. Их вторичная структура отличается от вторичной структуры интронов II и III группы.

Существуют две альтернативные теории, объясняющие происхождение и эволюцию сплайсосомных интронов: так называемые теории ранних интронов (РИ), которую высказал Джилберт (Gilbert), и поздних интронов (ПИ). Теория РИ утверждает, что многочисленные интроны присутствовали в общих предках эу- и прокариот и, соответственно, интроны являются очень старыми структурами. Согласно этой модели, интроны были потеряны из генома прокариот. Также она предполагает, что ранние интроны способствовали рекомбинации экзонов, представляющих домены белков. ПИ утверждает, что интроны появились в генах относительно недавно, и были инсертированы (вставлены) в геном после разделения организмов на про- и эукариоты. Эта модель основывается на наблюдении, что сплайсосомные интроны есть только у эукариот.

Предположение об эволюционной функции разорванных генов высказал Джилберт (Gilbert). Интронами часто разделяются кодирующие последовательности, с которых транслируются функциональные домены внутри белков. Так, например, глобиновые гены разделены двумя интронами на три кодирующих участка. Центральный участок кодирует домен, связывающий гем. Если, как полагает Джилберт, интроны создают возможность для «перетасовки ДНК путем незаконных рекомбинаций», то в таком случае кодирующие последовательности для отдельных доменов могут вступать в новые комбинации друг с другом. Так, участок глобина, связывающий гем, возможно, первоначально составлял часть другого разорванного гена. Для эволюции будущего глобинового гена, возможно, не понадобилось дупликации гена и дивергенции: простой перетасовки существующих доменов могло оказаться достаточным для создания нового белка из уже существовавших частей.

Лизоцимы фага Т4 и куриного яйца содержат структуры, к которым по мнению Артымюка и др. применимо подобного рода эволюционное объяснение. Лизоцимы куриного яйца содержат два таких же домена как в лизоциме фага Т4. Один из них - это домен, содержащий каталитический центр, а другой - соседний - домен, по-видимому, участвует в определении субстратной специфичности. N-концевой домен лизоцима куриного яйца, который, как установили Янг и др. , содержит сигнальный пептид прелизоцима и начальные аминокислоты молекул зрелого белка, не имеет эквивалента в лизоциме фага Т4. Точно так же четвертые, С-концевые, домены этих двух белков очень сильно различаются; по мнению Мэтьюза и др. , в фаговом ферменте функция этого домена состоит в том, чтобы обеспечивать прикрепление фаговой частицы к стенке Escherichia coli, тогда как ферменту куриного яйца эта функция вряд ли необходима. Подобный характер строения гомологичных белков, когда к сходным доменам примыкают несходные, явно совместим с предположением о перетасовке соответствующих кодирующих последовательностей путем рекомбинации в пределах интронов.

Джилберт высказал мнение, что если функция интронов сводится к обеспечению эволюционной пластичности, то они могут утрачиваться в результате нейтрального дрейфа. Он считает, что это происходит с исключительно низкой скоростью. Если согласиться с тем, что длительная эволюционная пластичность служит достаточным механизмом для сохранения разорванных генов, то старая теория о старении расы, к которой так часто прибегали в конце XIX в., чтобы объяснить вымирание различных групп (от аммонитов до динозавров), может быть возрождена в новой форме. Постаревшими будут считаться те группы, которые в результате дрейфа потеряли так много интронов, что утратили способность противостоять давлению отбора путем возникновения эволюционных новшеств. Однако здесь мы сталкиваемся с той же самой логической ошибкой, которая была присуща старой теории преформизма: все интроны должны были присутствовать изначально, а затем запас их должен медленно истощаться. Представляется более вероятным, что новые интроны могут возникать и что их сохранение связано с какой-то непосредственной функцией, выполняемой ими в клетке. Это не означает, однако, что отрицается возможность дополнительной эволюционной роли интронов в перетасовке ДНК.

Важную роль интронов в регуляции генной экспрессии продемонстрировали Лазовска, Жак и Слонимски (Lazowska, Jacq, Slonimski) в своем  исследовании гена box, который локализован в митохондриальном геноме дрожжей и кодирует цитохром b. Физическая карта гена box и кластеров известных для него мутационных сайтов представлены на рисунке

 В этом гене имеется шесть кодирующих последовательностей и пять интронов; у него обнаружены три различных класса мутаций. Мутации в кодирующих последовательностях, как и следовало ожидать, влияют на строение белка, и все они входят в одну группу комплементации. Мутации двух других классов необычны. Три кластера локализованы в интронах. Они в свою очередь образуют три различные группы комплементации и блокируют процессинг транскрипта гена цитохрома b. Они оказывают также воздействие на экспрессию гена oxi-3 - еще одного разорванного митохондриального гена, который кодирует субъединицу 1 цитохромоксидазы. Мутации третьего класса локализованы на границах между интронами и кодирующими последовательностями.

Для того чтобы могла образоваться функциональная мРНК для цитохрома b, интронные последовательности должны быть вырезаны из первичного транскрипта и должен произойти сплайсинг кодирующих последовательностей. Оказалось, однако, что процессинг - сложный многоступенчатый процесс. Мутации в интроне гена bох-3 нарушают процессинг, потому что этот интрон действительно транслируется, чтобы мог образоваться белок, необходимый для процессинга транскрипта гена box. Последовательность в этом интронном участке, определяющем синтез данного белка, известна, так как этот участок гена box был секвенирован.

Первый этап сплайсинга первичного транскрипта гена box, схематически представленного на рисунке, приводит к образованию РНК, содержащей кодирующую последовательность bох-4/5 для цитохрома b, сцепленную с маленьким кодирующим участком у конца интрона box-3. Эта РНК, содержащая кодирующие последовательности для цитохрома b и интронные последовательности, функционирует как мРНК, обеспечивая синтез белка матуразы, необходимого для следующей ступени процессинга. На этом этапе происходит удаление последовательности интрона box-3, с тем чтобы образовалась мРНК, содержащая только последовательности, кодирующие цитохром b. Подобным же образом интрон box-7 также, по-видимому, продуцирует сходную, хотя и другую матуразу, поскольку мутации box-3 и box-7 комплементарны друг другу. Гипотетическая матураза box-7, по-видимому, не только участвует в процессинге гена цитохрома b, но необходима также для процессинга транскрипта гена oxi-3, поскольку мутации в интроне bох-7 воздействуют на синтез цитохромоксидазы.

Роль процессинга в регуляции генной экспрессии выявляется также в примерах с α-амилазами из печени и слюнной железы мышей. Хагенбюхль и др.  обнаружили, что последовательности мРНК в ферментах печени и ферменте слюнной железы идентичны по своим кодирующим участкам и нетранслируемым 3'-участкам. Однако нетранслируемые 5'-участки этих мРНК различны. Данные названных авторов позволяют предполагать, что эти белки кодируются одним и тем же геном, но что его экспрессия, возможно, регулируется тканеспецифичным процессингом транскриптов. Очевидно, что разорванные гены играют важную роль в регуляции координированной генной экспрессии у эукариот и что существование подобной организации генов делает возможной значительную эволюционную пластичность.

С момента открытия интронов научное сообщество начало активные теоретические и экспериментальные попытки оправдать существование этих на первый взгляд бессмысленных вставок между белок-кодирующими областями эукариотического гена. И, надо заметить, весьма в этом преуспело.
Во-первых, было показано, что наличие интронов открывает возможность альтернативного сплайсинга, благодаря которому один ген может кодировать несколько различных белков.
Во-вторых, было показано, что некоторые интроны содержат энхансеры и способны активно регулировать экспрессию генов, которым они принадлежат.
И, наконец, третьим важным открытием оказалось то, что транскрибированные интроны, входящие в состав незрелых мРНК, способны участвовать в организации процессов авторегуляции. На примере рибосомальных белков L30 и S14 было показано, что эти белки способны специфически связывать участки одного из интронов своих собственных пре-мРНК, нарушая их дальнейшее созревание, а следовательно экспорт и трансляцию. Поскольку в условиях повышенного уровня L30 и S14 их синтез прекращается, а в условиях их недостатка - активно протекает, в клетке устанавливается равновесие, поддерживающие количества этих белков в клетке на оптимальном уровне.
Исследования механизма авторегуляции в похожей системе - белка Yra1p почкующихся дрожжей и интрона его гена, открыли новую и как нельзя более простую функцию интрона - служить спейсером между двумя экзонами.
Yra1p представляет собой белок, необходимый для экспорта мРНК из ядра в цитоплазму. В нормальных условиях количество Yra1p регулируется по принципу отрицательной обратной связи интроном его собственного гена, делеция которого приводит к увеличению внутриклеточного уровня Yra1p и в конечном счете – к гибели клетки, так как большие количества Yra1p токсичны.
Интрон-регулятор белка Yra1p имеет нехарактерные для почкующихся дрожжей признаки:
1. он необычайно велик (второй по велечине в геноме этого вида дрожжей),
2. сильно удален от AUG-кодона,
3. а также не содержит консенсусных участков, по которым протекает вырезание большинства интронов дрожжей.
Особенности интрона, в первую очередь – его размер, приводят к тому, что сплайсинг пре-мРНК Yra1p протекает относительно медлено.
Исследуя механизм действия этого интрона P.Preker и C.Guthrie из University of California, San Francisco показали, что его частичные делеции увеличивают эффективность сплайсинга пре-мРНК, но вместе с тем ухудшают способность интрона регулировать уровень Yra1p вплоть до ее полной потери. Ключевым экспериментом оказалась замена интрона на непохожий по последовательности, но похожий по размеру фрагмент ДНК, которая никак не отразилась на системе авторегуляции. Этот эксперимент показал, что в отличие от описанных систем авторегуляции L30 и S14 данный интрон в составе пре-мРНК скорее всего не содержит специфических участков связывания Yra1p.
Несмотря на то, что детальный механизм этого явления не установлен, складывается впечатление, что интрон функционирует как простой спейсер, удаляющий друг от друга экзоны, понижая эффективность сплайсинга пре-мРНК; последовательность случайных пар нуклеотидов определенной длины оказывается критически необходимой для жизни дрожжей.

Группа в составе Ian A. Swinburne, David G. Miguez, Dirk Landgraf под руководством Pamela A. Silver из Department of Systems Biology, Harvard Medical School, Boston провела работу, в ходе которой было выяснено, что интроны могут влиять на экспрессию генов через увеличение времени, необходимого для транскрипции гена. С одной стороны время транскрипции увеличивается через отрицательную обратную связь. В работе показано, что смоделированная отрицательная обратная связь в клетках животных определяет ритм транскрипции, который имеет широкие пределы, возрастающие с длиной интронов. Эти результаты в комбинации с математическим моделированием позволяют предположить к чему может приводить интрон-зависимое изменение ритма. Был сделан вывод, что увеличение времени транскрипции, необходимое для генов, содержащих длинные интроны, очень важно для реализации программы экспрессии этих генов.

В 2001 году исследовательская группа из University College London под руководством Jurgen Roes занималась изучением механизмов экспрессии рекомбинантных генов in vivo, в том числе при генной терапии. В ходе этих исследований было выяснено, что при создании искусственных экзонов с помощью введения 2-х коротких интронов таким образом, что они находятся в открытой рамке считывания, продукция мРНК зеленого ффлуоресцирующего белка (GFP) и Cre-рекомбиназы бактериофага увеличиваются в 30 раз. Исследователями был сделан вывод, что этот метод применим для усиления экспрессии генов, вводимых с помощью векторов при генной терапии. Но мы можем сделать не менее важный вывод- наличие интронов несомненно влияет на экспрессию генов.

Некоторые гены, находящиеся в интронах кодируют не белки, микроРНК, которые, связываясь с мРНК, регулируют экспрессию генов. Исследованиями механизмов этого явления занимаются в Department of Cell and Neurobiology, Keck School of Medicine, University of Southern California.
Многие варианты микроРНК распространены у растений, животных и микроорганизмов. МикроРНК, происходящие из интронов (Id-miRNA)- это новый класс микроРНК, для биогенеза им необходима РНК- полимераза II и компоненты сплайсеосомы. Некоторые типы Id-miRNA идентифицированны у C. elegans, мыши и человека.
MiRNA связывается с мРНК с полной или частичной комплементарностью. Частичная комплементраность дает возможность использовать микроРНК в качестве конструкций для борьбы с полиморфизмам генов в опухолях и вирусными инфекциями.
Id-miRNA способны индуцировать РНК-интерференцию во многих клетках, что свидетельствует об эволюционном характере этой посттрансляционной регуляторной системы (статья).

В заключение необходимо сказать, что интроны и все, что с ними связано еще плохо исследовано. Недостаточно исследованы механизмы сплайсинга, недостаточно изучены функции интронов. Но виден несомненный прогресс: если еще недавно интроны считались каким-то непонятным "генетическим мусором", ненужными фрагментами генов, которые существуют неизвестно для чего и выбрасываются при сплайсинге мРНК, то теперь очевидна их важность. Как упоминалось выше, наличие интронов в структуре гена открывает возможности для альтернативного сплайсинга. Кроме того, интроны могут содержать некодирующие регуляторные последовательности, которые определяют экспрессию генов. Также интроны могут участвовать в авторегуляции процессинга мРНК.
Резюмируя все вышесказанное, хочется напомнить о необходимости дальнейших исследований. Особенно нужны они в сфере геронтологии и онкологии. Как и любой фактор, влияющий на экспрессию генов, существование и аномальное функционирование интронов может приводить к аномальной экспрессии генов или к появлению аномальных белков. Есть информация, что наличие СА-повторов в интронах гена эпидермального фактора роста влияет на развитие и прогноз рака груди.
 Кроме того, ведутся исследования о роли полиморфизмов различных генов в возникновении сосудистых аномалий- аневризмы аорты и субарахноидальных кровотечений у различных этнических групп. В возникновении этих полиморфизмов не последнюю роль играют изменения в интронах этих генов.
Сейчас ведутся исследования полиморфизмов (в том числе и в интронах) различных генов, ассоциированных с различными заболеваниями, в основном в каких-либо этнических группах. Необходимо систематизировать эти исследования.
Нужно активизировать исследования в следующих направлениях:

1) исследования роли интронов

2) исследования механизмов их функционирования

3) исследования регуляторных последовательностей, локализующихся в интронах

4) исследование изменений в интронах, связанных с различными заболеваниями

5) и самое ГЛАВНОЕ- исследования связи функционирования и изменений в интронах с процессом старения. Работ, хоть как-то косвенно затрагивающих эту проблему, ужасающе мало, а это должно стать главным направлением.

10 октября 2008 года