3
19355

Белки теплового шока

Белки теплового шока (HSPs) - самые "вездесущие" растворимые белки. В компасе рассматриваются некоторые их свойства в норме, при старении и ряде патологических состояний.

на сайте с 15 января 2009

Ответ на тепловой шок. Белки стресса

    В 1962 году в Италии молодой генетик Ферруччио Ритосса обнаружил набухание (puffing) некоторых участков хромосом дрозофилы при случайном повышении температуры в термостате. Это оказалось проявлением активации генов и получило название "ответа на тепловой шок" (heat shock response) (ссылка), а индуцируемые белки были названы белками теплового шока, БТШ (heat shock proteins, HSP) В дальнейшем этот класс белков был найден во всех клетках всех живых организмов - от бактерий до человека.  Известно, что подобный ответ проявляется, кроме тепловых, при различных биологических (инфекция, воспаление), физических (радиация, гипоксия), химических (спирты, металлы) и других стрессорных воздействиях. Поэтому белки теплового шока называют также белками стресса. Повышенная экспрессия белков HSP защищает клетку, стабилизируя денатурированные или неправильно свернутые пептиды. Накапливаясь при различных вредных воздействиях, белки теплового шока помогают клетке поддерживать гомеостаз в условиях стресса (см). Белки HSP реагируют не только на внешние стрессовые ситуации, они проявляются при многих болезнях, как, например, нейродегенерация, метаболические нарушения, ишемические повреждения и рак, что определяет повышенный интерес к этим белкам и поиску терапевтичеких инструментов, регулирующих их реакции (2006, 2007, 2007а).  
     Белки теплового шока служат биологическими маркерами неблагоприятного состояния организма.

Факторы теплового шока


     Ответ клетки на стресс регулируется, прежде всего, на уровне транскрипции (ДНК в РНК) с помощью факторов теплового шока (heat shock factor, HSF) (статья). Семейство HSF содержит 4 вида, из которых у млекопитающих и человека экспрессируются HSF1, HSF2 и HSF4, причем HSF1 является универсальным стресс-реагирующим активатором, в то время как HSF2 больше связан с процессами дифференцировки. В отсутствие стресса эти факторы находятся в ядре и цитоплазме в мономерной форме и не способны связываться с ДНК. В ответ на стресс HSF образуют тримеры (возможны гомотримеры HSF1 либо гетеротримеры HSF1-HSF2)  (см.) и перемещаются в ядро, где они связываются с элементами теплового шока (HSE) - специфическими последовательностями ДНК в промоторах генов теплового шока. 


      Последующее фосфорилирование тримеров HSF сопровождается активацией транскрипции генов теплового шока и повышением уровня HSP, приводя к образованию комплексов HSF-HSP. Когда стресс прекращается, тримерные формы HSF отделяются от ДНК, превращаясь опять в неактивные мономеры, а клетка возвращается к нормальному белковому синтезу (ссылка). 
     Предполагается, что белки теплового шока сами могут регулировать экспрессию своих генов через "петлю авторегуляции". Согласно этой гипотезе, увеличение концентрации неправильно свернутых белков, возникшее при стрессе, приводит к связыванию специфических HSP и активации HSF. 

Белки теплового шока как молекулярные шапероны


     Дальнейшее изучение класса HSP показало, что эти белки не только индуцируются при стрессе, но многие из них функционируют конститутивно как молекулярные шапероны, участвуя в стабилизации и перемещении незрелых пептидов при нормальном росте. Например, белки Hsp70, Hsp90  присутствуют в высоких концентрациях в не-стрессовых клетках, составляя 1-1,5% общего клеточного белка, что указывает на постоянную потребность клетки в поддержании конформационного гомеостаза ее белков. Эти белки находятся в цитозоле, митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме и ядре. Молекулярные массы HSP лежат в пределах 15-110 кДа. Наиболее изученными у млекопитающих являются белки HSP 60, 70, 90 и 110 кДа, которые играют важную роль в фундаментальных внутриклеточных процессах - от антиапоптозного действия до разворачивания и внутриклеточного перемещения белков.   
     Функции БТШ как шаперонов можно свести к следующим: 
 1. Свертывание незрелых полипептидных цепей; 
 2. Облегчение перемещения белков через разные клеточные  компартменты; 
 3. Модуляция белковой активности за счет стабилизации и/или созревания до функционально компетентной конформации; 
 4. Поддержка образования/расщепления мультибелковых комплексов
 5. Исправление неправильно свернутых белков; 
 6. Защита белков от агрегации
 7. Направление полностью поврежденных белков к расщеплению
 8. Организация агрегатов из разрушенных белков; 
 9. Солюбилизация белковых агрегатов для дальнейшей деградации.
   


 

Ко-шапероны

      Активность белков теплового шока регулируется другими белками -  ко-шаперонами , которые способствуют выполнению основных функций HSP. Хотя многие ко-шапероны являются растворимыми цитозольными белками, некоторые из них локализованы во внутриклеточных мембранах или элементах цитоскелета. Эти специализированные ко-шапероны включают ауксилин, Tom70, UNC-45, гомологи Bag-1. Ко-шапероны могут участвовать в АТФ-зависимой активности HSP70 и HSP90, включая такие функции, как секреция, белковый транспорт и образование/расщепление белковых комплексов (ссылка).  
     Ко-шапероны Hip, Hop, Hup, CHIP модулируют нуклеотидный обмен и связывание субстратов белками HSP70, координируя свертывание новосинтезированных белков, исправляют неправильное свертывание поврежденных и денатурированных белков, направляют перенос белков через клеточные мембраны, ингибируют агрегацию белков и осуществляют деградацию по протеасомальному пути (статья).


                          Функции некоторых ко-шаперонов

       Белки HSP70 вместе с ко-шарепонами  осуществляют, по меньшей мере, 2 альтернативных вида активности: предотвращают агрегацию не-нативных белков при связывании с гидрофобными участками молекул субстратов, защищая их от межмолекулярных взаимодействий ("охранная", "holder" активность), а также способствуют свертыванию не-нативных интермедиатов до нативного состояния ("свертывающая", "folder" активность).

HSP и АТФ-азный цикл


     Белки теплового шока у млекопитающих представлены 6 семействами в зависимости от молекулярной массы: Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40 и малые Hsps (15 to 30 kDa), включающие Hsp27. Высокомолекулярные HSP являются АТФ-зависимыми, а активность малых HSP не зависит от АТФ.  
     Генетические и биохимические данные показали, что гидролиз АТФ является существенным элементом активности шаперонов HSP70. Белки этого семейства связываются с промежуточными пептидами за счет циклов связывания и гидролиза АТФ, а последующий обмен АДФ/АТФ сопровождается освобождением пептидов. Молекулы HSP70 содержат две консервативных области - N-концевую АТФ-связывающую (45 кДа) и  С-концевую (15 кДа), связывающую гидрофобные пептиды. Между ними находится более вариабельная область альфа-спиральной "крышки". АТФ-связанный HSP70 ("крышка" открыта) свободно взаимодействует с незрелыми или неправильно свернутыми пептидами, вызывая конформационные изменения, которые приводят к активации АТФ-азы и усиливают ассоциацию с ко-шапероном HSP40, что способствует переходу к АДФ-связанной ("крышка" закрыта) форме. Для эффективного сопряжения гидролиза АТФ со связыванием и последующим освобождением пептидных субстратов существенны ко-шапероны семейства JDP (J-domain proteins) (2005; 2009). 

Белки теплового шока при ишемии


     Цитопротекторные свойства белков класса HSP70 были показаны на различных моделях ишемических нарушений in vitro и in vivo (1996, 19971998, 2000, 2004 , 2005). Вначале эта защита объяснялась действием HSP как шаперонов (поддержанием правильного свертывания белков  и предотвращением их агрегации), но затем выяснилось, что HSP70 могут напрямую реагировать с путями клеточной смерти - апоптозом и некрозом
     Как видно из рисунка, церебральная ишемия  индуцирует апоптоз разными способами, а HSP70 уменьшает действие их всех. "Внутренний" путь апоптоза состоит в выделении про-апоптозных митохондриальных веществ, открытии митохондриальной поры и активации каспаз (см.). Другой ("внешний") путь связан с активацией рецепторов плазматической мембраны (Fas и TNFR), индуцирующих апоптоз через каспазу-8, используя фактор TRAF. Кроме того, известны механизмы каспаз-независимого апоптоза (см.). 
     Белки HSP70 могут ингибировать освобождение цитохрома с (cyt c)  из митохондрий и транслокацию индуцирующего апоптоз фактора AIF в ядро, уменьшая ишемическое повреждение мозга (см.), а также ингибировать освобождение проапоптозного белка Smac/DIABLO из митохондрий миоцитов.  
     Экспрессия HSP72 в астроцитах приводит к снижению образования реактивных видов кислорода (ROS) и поддержанию мембранного потенциала митохондрий, а также уровня глутатиона и увеличению активности супероксиддисмутазы при ишемических нарушениях в кардиоцитах.
     Повышенная экспрессия HSP72 способна уменьшать апоптоз прямо через увеличение уровня Bcl-2 и с помощью ингибирования транслокации проапоптозного фактора Bax. 
     Показано, что белки класса HSP70 ингибируют дефосфорилирование киназы JNK (c-Jun N-terminal kinase), которая играет существенную роль в нейрональном апоптозе и является одной из мишеней для терапии инсультов.
     Кроме того, белки Hsp взаимодействуют с топоизомеразой 1(регулятором апоптоза) и являются эффекторами важной антиапоптозной киназы Akt/PKB (см). Значительная активация белками теплового шока глутатион-пероксидазы и глутатионредуктазы является существенным элементом в механизме цитопротекторного действия HSP при ишемии (статья).

Противовоспалительный эффект белков теплового шока


     Белки теплового шока оказывают выраженное противовоспалительное действие, предотвращая ответы клеток на такие воспалительные цитокины, как TNF и IL-1.   
     Известно, что при воспалении образуются ROS за счет активации индуцируемой формы NO-синтазы (iNOS)  и NADPH-оксидазы, причем iNOS возникает в ответ на выделение цитокинов. Синтезируемая iNOS закись азота (NO) реагирует с супероксидом, образуя высокотоксичный окислитель пероксинитрит:   -O2− + -NO → ONOO− 
а HSP72 ингибирует экспрессию iNOS, уменьшая активацию NFkappaB (ссылка). Кроме того, белки теплового шока снижают активность  NADPH-оксидазы в нейтрофилах и активируют супероксиддисмутазу в фагоцитах, а также регулируют активность матричных металлопротеиназ в астроцитах.
     Значительная часть внутриклеточных эффектов белков HSP при воспалении связана с регуляцией ими пути ядерного фактора NFκB, так как факторы транскрипции этого семейства являются ключевыми участниками запуска воспалительной реакции. Транслокация димеров, составляющих NFkB, в ядро, где они индуцируют экспрессию многих воспалительных генов, ингибируется белками теплового шока за счет прямого взаимодействия либо через влияние на сигнальные пути NFkB. 
     Показано также, что Hsp72 взаимодействует с киназным комплексом IKK, необходимым для освобождения NFkB и перехода его в ядро.
     Таким образом, белки класса HSP70 используют много путей для предотвращения воспалительных процессов в организме (обзор).

Внеклеточное действие белков теплового шока


    Белки HSP долгое время считали цитоплазматическими, функции которых ограничены внутриклеточным компартментом. Однако в последнее время возрастает число наблюдений о том, что эти белки могут выделяться во внеклеточную среду и оказывать действие на другие клетки. Впервые это было показано на глиальных клетках гигантского аксона кальмара, освободившиеся из которых белки HSP70  переходили внутрь аксона.  Работами нескольких лабораторий исследовано влияние выделенных из астроцитов или шванновских клеток HSP72 на соседние нейроны и аксоны. Внеклеточные эффекты HSP получены также на клетках эпителия , эмбриональных клетках крысы , В-лимфоцитах , дендритных  и опухолевых клетках.   
     Показано, что внеклеточный HSP72 может индуцировать выделение цитокинов (TNF, IL-6, IL-1beta) из моноцитов, что обеспечивается рецепторами TLR2, TLR4 и активацией NFkB
     Внеклеточные HSP могут взаимодействовать с липидами клеточных мембран и встраиваться в мембраны, образуя АТФ-зависимые катионные каналы (см.).  Кроме того, HSP72, взаимодействуя с фосфатидилсерином на поверхности апоптозных клеток, ускоряет гибель этих клеток.  
     Наблюдается значительная корреляция между повышенным уровнем сывороточного HSP70 и снижением развития атеросклероза, определяемого по толщине интимы сонной артерии (статья).
     Терапевтическое значение может иметь также тот факт, что у больных с коронарной недостаточностью наблюдается обратная корреляция между уровнем HSP70 в сыворотке крови и степенью риска этого заболевания, показанной ангиограммой коронарной артерии (см.).

 

Роль белков теплового шока в иммунных реакциях


     Способность класса HSP взаимодействовать с большим количеством белков и пептидов определила его уникальную роль в выживании организмов благодаря участию во врожденных и адаптивных иммунных ответах. Иммунологические функции HSP были впервые обнаружены в 80-х годах прошлого века, когда гомогенные препараты некоторых HSP, выделенных из раковых клеток, оказались иммунными к раку, а соответствующие препараты их нормальных тканей не обладали этим свойством (ссылка).  
     Последующие исследования показали, что белки теплового шока, связываясь с пептидами, осуществляют свои иммунные функции совместно с системами МНС I и МНС II  . Механизмы иммунизации с помощью HSP-пептидных комплексов, оказывающих мощные противоопухолевые, антивирусные и антипаразитарные эффекты, могут быть различными. Так, с одной стороны, взаимодействие этих комплексов с клетками, "представляющими" антиген (antigen-presenting cell, APC), как макрофаги или дендритные клетки, позволяет переносить антигенные пептиды к Т-лимфоцитам (CD8+ и CD4+) , а с другой стороны, приводит к каскаду событий, активирующих APC и вызывающих иммунные ответы.
     Приведенный выше рисунок суммирует все эти механизмы - стимуляцию белками теплового шока Т-лимфоцитов через рецептор CD91 (антиген-специфическое действие) и не антиген-специфическое действие (например, выделение цитокинов и хемокинов, созревание дендритных клеток и др., использующие другие виды рецепторов) (ссылка). 

HSP и противораковая терапия

      Белки теплового шока высоко экспрессируются при многих видах рака у человека и участвуют в пролиферации, дифференциации, метастазировании и узнавании опухолевых клеток иммунной системой.  Они являются полезными биомаркерами канцерогенеза в некоторых тканях и сигнализируют о степени дифференциации и агрессивности некоторых видов рака. Кроме того, уровень циркулирующих HSP и анти-HSP антител может быть полезным для диагностики рака.  Повышенная экспрессия HSP может также иногда предсказывать ответ на противораковое лечение. Например, HSP27  и HSP70 причастны к сопротивлению химиотерапии при раке груди, повышение уровня HSP27 предсказывает плохую реакцию на химиотерапию при лейкемии. В то же время экспрессия HSP70 предполагает хорошие химиотерапевтические эффекты при остеосаркомах ( см. обзор ).  
     В развитии противораковой терапии с участием HSP сыграла роль их двойная функция в организме: с одной стороны - внутриклеточная цитозащитная/анти-апоптозная, а с другой - внеклеточная/иммуногенная
     Это позволило разработать 2 основные стратегии в противораковой терапии
 1) Фармакологическая модификация экспрессии HSP и их активности в качестве молекулярных шаперонов; 
 2) Применение HSP в противораковых вакцинах на основании их способности действовать в качестве иммунологических адъювантов.  
       Наиболее перспективным в качестве антиканцерной фармакологической мишени оказался белок HSP90. Его уровень составляет 1-2% от общего содержания белков в отсутствие стресса, а количество его белков-клиентов превышает 100, многие из которых связаны с онкогенезом. Повышенная экспрессия HSP90 обнаружена при опухолях груди, раке легких, лейкемиях, болезни Ходжкина, лимфомах и других онкологических заболеваниях. Поэтому ингибирование HSP90 может разрушать одновременно большое количество онкогеных сигнальных путей. Разработкой ингибиторов HSP90 занимается множество лабораторий (2002, 2005, 2007а, 2007b и др.). 
     Естественные ингибиторы HSP90 - гелданамицин (GA) и 17-аллиламино-17-деметоксигелданамицин (17-AAG) - взаимодействуют с АТФ-связывающим участком молекулы HSP90 с более высоким сродством, чем натуральные нуклеотиды, и препятствуют АТФ-АДФ переходам белка, нарушая активность HSP90 как шаперона, а его белки-клиенты деградируются протеасомой. Существенно, что ингибиторы HSP90, удаляя белки-клиенты в раковых клетках, не влияют на те же белки в нормальных тканях, так как их сродство к HSP90, выделенному из опухолей, в 20-200 раз выше (см.).
     Подробно об естественных и искусственных ингибиторах белков теплового шока и механизмах их действия можно прочитать в обзорах 2007, 2009.


     Способность белков теплового шока связывать пептиды-антигены легла в основу иммунотерапевтического подхода к лечению онкозаболеваний. Выделенные из опухолей онкологических больных пептидные комплексы Hsp70 и Grp96 используются в качестве антираковых вакцин для лечения и предупреждения рака. Белки теплового шока, кроме проявления шапероновой активности к опухолевым пептидным антигенам, облегчают вхождение в клетки HSP-пептидных комплексов за счет рецепторного эндоцитоза. Это позволило достаточно быстро перенести основанные на HSP вакцины от изучения на моделях животных к лечению раковых заболеваний в клинике. Улучшенные формы HSP-вакцин получаются при выделении HSP70-пептидных комплексов из дендритных клеток, слившихся с опухолевыми
   Прамод К. Сривастава (Pramod K. Srivastava, a professor of medicine and director of the Center for Immunotherapy of Cancer and Infectious Diseases at the University of Connecticut School of Medicine) - один из первых исследователей роли белков теплового шока в иммунной системе. С его участием создана компания Antigenics, успешно разрабатывающая противораковые вакцины на основе HSP, выделенных из индивидуальных опухолей пациентов.
 

 Эти препараты, основанные на различных белках теплового шока, в настоящее время проходят клинические испытания.

Белки теплового шока при старении


     По мере старения организмы утрачивают способность адекватно реагировать на внешние стрессы и поддерживать гомеостаз. Старые клетки более подвержены нарушениям и болезням, поэтому с возрастом растет восприимчивость к этим факторам.
     В течение жизни стабильного белка в нем возникают различные посттрансляционные изменения. Стабильность белков нарушается за счет многочисленных вредных воздействий - окисления боковых цепей, гликации, дезаминирования аспарагиниловых и глутаминиловых остатков, что приводит к образованию изопептидных связей. Чувствительность к протеотоксичным повреждениям возрастает из-за ошибок в транскрипции и трансляции и проявляется дефектами свертывания белков. Для старения характерен рост модификаций белка, связанных с гомеостазом свертывания (см.). Функции шаперонов нарушаются, увеличивается потребность в деградации белков, но активность главного протеолитического аппарата, протеасомы, также снижается с возрастом, приводя к опасности гликации. Агрегация также сопровождается ингибированием протеасом и остановкой клеточного цикла. С возрастом нарушается и лизосомальная деградация белков (возможно, за счет подавления липофусцином). Накопление неправильно свернутых белков и ослабление защитных механизмов приводит к образованию белковых агрегатов, нарушающих клеточные функции и являющихся причиной возрастных болезней
    Для всех изученных видов организмов характерно наличие денатурированных и агрегированных белков в стареющих клетках. У человека многие возраст-зависимые заболевания (болезни Альцгеймера, Паркинсона, прионные болезни и др.) сопровождаются накоплением неправильно расщепленных и/или свернутых белков,  что связано с нарушением функций HSP.
    Ричард Моримото (Richard I. Morimoto, Professor of Biochemistry, Molecular Biology and Cell Biology, Rice Institute for Biomedical Research, Northwestern University, USA) исследовал связь между функциями белков теплового шока и генетическими путями, регулирующими процессы старения. На модели C. elegans было показано, что гены инсулин-подобного сигнального пути (insulin-like signaling (ILS) pathway), регулирующие старение и продолжительность жизни, являются мощными модуляторами агрегационной токсичности, связанной с образованием полиглутаматных комплексов PolyQ, которые характерны для ряда нейродегенеративных болезней.  Активация рецептора ILS - DAF-2 запускает киназный каскад, включающий фосфатидилинозитол-3-киназу (AGE-1), АКТ/РКВ и РDK. Фосфорилирование этими киназами ингибирует фактор транскрипции DAF-16, удлиняющий продолжительность жизни модельных организмов. Мутации daf-2 или age-1, ингибируя этот путь, вызывают дерепрессию DAF-16, т.е. способствуют сопротивлению стрессам и долгожительству. 
   Кроме того, оказалось, что фактор теплового шока 1 (HSF1) и молекулярные шапероны (HSP), существенные для поддержания гомеостаза свертывания белков, также являются регуляторами продолжительности жизни. Инактивация daf-16, hsf1 или малых белков теплового шока приводила к увеличению полиглутаматной агрегации белков и ускоряла старение организмов, поддерживая предположение, что ILS может влиять на процесс старения и агрегацию белков через действие DAF-16 и HSF1. Подавление отдельных белков HSP, мишеней транскрипции HSF1, также уменьшало продолжительность жизни долгоживущих мутантов (Hsu et al. 2003; Morley and Morimoto, 2004).
     Взаимодействие между ILS и HSF1 может являться важной стратегией, объединяющей регуляцию старения и предыдущие генетические подходы, связанные со способностью клетки отвечать на стресс. 
      Одним из недавних открытий, связывающих белки теплового шока и старение, можно считать обнаружение роли деацетилазы SIRT1 (фактора долгожительства)  как активатора  HSF1. Этот факт дополняет полученные ранее данные об участии HSF1 в регуляции продолжительности жизни. Таким образом, HSF1 оказывается в центре регуляторной цепи, связывающей стресс, питание и долголетие. Добавление HSF1 к этой стресс-регулирующей системе включает гомеостаз белков в осуществляемую SIRT1 защиту клетки и позволяет объяснить возраст-зависимое снижение ответа на тепловой шок (по крайней мере, частично) ослаблением регуляции сиртуинами активности фактора теплового шока HSF1. С другой стороны, это позволяет ожидать, что активаторы деацетилазы SIRT1 (например, ресвератрол) будут усиливать ответ клетки на тепловой шок, увеличивая продолжительность жизни (ссылка).


 

Вместо заключения

      "Вездесущие" белки телового шока (они же белки стресса, молекулярные шапероны) изучают во многих лабораториях мира. Кроме уже упомянутых ученых, назовем еще некоторых:
    Лия Систонен (Lea Sistonen, Academy Professor of Department of Biology, Turku Centre for Biotechnology, University of Turku and Abo Akademi University, Finland) с сотрудниками исследуют транскрипционную регуляцию ответа на тепловой шок (2002, 2003, 2006, 2008, 2009).
     Работы Ксаба Соти (Csaba Soti, Semmelweis University,  School of Medicine, Department of Medical Chemistry, Laboratory of Chaperone Molecules,  Hungary) связаны с возрастными аспектами ответа клетки на тепловой шок  - от конкретных молекулярных механизмов до описания сложных шапероновых сетей (2006, 2007, 2008).
 
 

  
     В лаборатории Эрика Вердина (Eric Verdin, Senior Investigator of Gladstone Institute of Virology and Immunology, Professor of Medicine of University of California, USA) получены очень важные результаты о связи деацетилаз сиртуинов с белками стресса и старением (2009).
   

 

      Исследования проф. Джона Тауэра (John Tower, Molecular and Computational Biology Program, Department of Biological Sciences, University of Southern California,  USA) посвящены белкам HSP как биомаркерам старения (2009).

 
    

    

Нужно надеяться, что совместные усилия научных коллективов позволят эффективно использовать белки теплового шока как инструменты для борьбы с возраст-зависимыми болезнями и приведут к радикальному продлению жизни.
    

ЛИТЕРАТУРА ПО ТЕМЕ

Комментарии

2 июня 2009 в 11:11
 
Замечательный компас, столько интересной информации! Как же можно обяснить, что если эти белки, по сути, просто необходимые клетке в качестве "контроля" над правильно свёрнутыми белками, всё же считаются опухолевыми маркерами и их экспрессия даже повышается при трансформации?
29 марта 2012 в 19:43
 
Диагностика или другие манипуляции как предмет научного исследования. В этой сфере могу помочь через pr-avp@mail.ru - диссертацию докторскую или кандидатскую создам на заказ без посредников по устному договору на высшем уровне – медицина, биология, экология, социальная медицина, социология, безопасность. Содействие в публикациях, участие в процедуре защиты. Доктор наук, профессор.

Оставить комментарий

Поделиться с друзьями

Share on Twitter