Генетический аппарат митохондрий

Митохондрии представляют собой окруженные двойной мембраной органеллы , специализирующиеся на синтезе АТФ - путем транспорта электронов и окислительного фосфорилирования. Хотя они имеют свою собственную ДНК и аппарат белкового синтеза, большинство их белков кодируется клеточной ДНК и поступает из цитозоля. Более того, каждый поступивший в органеллу белок должен достичь определенного субкомпартмента, в котором он функционирует. В митохондриях имеется четыре субкомпартмента:
- митохондриальный матрикс
- внутренняя мембрана
- межмембранное пространство
- внешняя мембрана , обращенная к цитозолю.

Немногие белки, которые кодируются собственным геномом митохондрий, расположены в основном во внутренней мембране. Они обычно образуют субъединицы белковых комплексов, другие компоненты которых кодируются ядерными генами и поступают из цитозоля. Образование таких гибридных агрегатов требует сбалансирования синтеза этих двух типов субъединиц; каким образом координируется синтез белка на рибосомах разных типов, разделенных двумя мембранами, остается загадкой.

Как известно, митохондрии являются структурами, которые осуществляют синтез аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) - основной энергетической единицы всего царства живого. Обычно митохондрии представляют собой мелкие (длиной 0,5-3 мкм) внутриклеточные образования, располагающиеся в местах, где необходимо использование энергии для любых жизненных процессов. Возник вопрос, каким образом транспортируется в клетке энергия - путем ли диффузии АТФ? Есть ли в клетках структуры, исполняющих роль электрических проводников, которые могли бы энергетически объединять отдаленные друг от друга участки клетки? Гипотеза заключается в том, что разность потенциалов в определенной области мембраны митохондрий передается вдоль нее и превращается в работу в другой области той же мембраны.

Как представлялось, подходящими кандидатами на эту же роль могли быть мембраны самих митохондрий. Кроме того, исследователей интересовали взаимодействие в клетке множественных митохондрий друг с другом, работа всего ансамбля митохондрий, всего хондриома - совокупности всех митохондрий.

Митохондрии характерны за малым исключением для всех эукариотических клеток как аутотрофных (фотосинтезирующие растения), так и гетеротрофных (животные, грибы) организмов. Их основная функция связана с окислением органических соединений и использованием освобождающейся при распаде этих соединений энергии в синтезе молекул АТФ. Поэтому митохондрии часто называют энергетическими станциями клетки. Митохондрии или хондриосомы (от греч. mitos - нить, chondrion - зернышко, soma - тельце) представляют собой гранулярные или нитевидные органоиды. Митохондрии можно наблюдать в живых клетках, так как они обладают достаточно высокой плотностью. В живых клетках митохондрии могут двигаться, перемещаться, сливаться друг с другом. Особенно хорошо митохондрии выявляются на препаратах, окрашенных различными способами. Размеры митохондрий непостоянны у разных видов, так же как изменчива их форма. Все же у большинства клеток толщина этих структур относительно постоянна (около 0,5 мкм), а длина колеблется, достигая у нитчатых форм 7-60 мкм.

Митохондрии независимо от их величины и формы имеют универсальное строение, их ультраструктура однообразна. Митохондрии ограничены двумя мембранами. Наружная митохондриальная мембрана отделяет ее от остальной цитоплазмы. Ее толщина около 7 нм, она не бывает связана ни с какими другими мембранами цитоплазмы и замкнута сама на себя, так что представляет собой мембранный мешок. Наружную мембрану от внутренней отделяет межмембранное пространство шириной около 10-20 нм. Внутренняя мембрана (толщиной около 7 нм) ограничивает собственно внутреннее содержимое митохондрии, ее матрикс или митоплазму . Характерной чертой внутренних мембран митохондрий является их способность образовывать многочисленные выпячивания внутрь митохондрий. Такие выпячивания ( кристы ) чаще всего имеют вид плоских гребней. Митохондрии осуществляют синтез АТФ, происходящий в результате процессов окисления органических субстратов и фосфорилирования АДФ.

Хондриом клетки (совокупность митохондрий) может иметь различную композицию в зависимости от энергетических потребностей клетки. В простейшем (и чаще встречающемся) случае он может быть представлен множеством разрозненных небольших митохондрий, функционирующих независимо друг от друга и снабжающих АТФ небольшие участки цитоплазмы. В других случаях длинные и разветвленные митохондрии могут энергетически обеспечивать отдаленные друг от друга участки клетки. Вариантом такой протяженной системы может быть хондриом типа митохондриального ретикулума, который встречается как у одноклеточных, так и у многоклеточных организмов. Особенно сложно этот вид хондриома выражен в скелетных мышцах млекопитающих, где группы гигантских разветвленных митохондрий связаны друг с другом с помощью специальных контактов (ММК). Наличие ММК характерно для хондриомов сократимых структур. Особенно обильно ММК представлены в клетках сердечных мышц, где они функционально связывают множественные отдельные митохондрии в единую разветвленную цепь.

Митохондриальный геном человека (мтДНК) состоит из кольцевой ДНК размером 16600 нуклеотидов (у млекопитающих цифра варьирут от 15 до 15 т.п.н.), которая кодирует рРНК и тРНК, участвующие в митохондриальной системе трансляции, и некоторые белки, необходимые для окислительного фосфорилирования.

Митохондриальные геномы эукариот, кодирующие примерно один и тот же набор функций, характеризуются различиями в смысловом значении некоторых кодонов, в правилах антикодон-кодонового узнавания и существенными различиями в общей структурной организации. Общим свойством всех митохондриальных геномов является максимальная структурная компактность при максимальной информационной нагруженности. Это достигалось за счет изменений генетического кода, которые позволили сократить необходимый для считывания набор тРНК. Митохондриальные генетические коды различных организмов не только отличаются от универсального генетического кода, но и различаются между собой. Исследования митохондриального кода показали, что он тоже собственный, варьирующийся от одного вида митохондрий к другим и в некотором отношении отличающийся от универсального кода эукариот. Наиболее изученный генетический код митохондрий позвоночных (в том числе и человека) показывает, что 22 антикодона тРНК «узнают» все 60 кодонов мРНК. Такая минимизация становится возможной благодаря особой структуре рРНК и рибосомального комплекса митохондрий и почти во всех случаях расположению Урацила в 1 положении антикодона тРНК, который способен «узнавать» все 4 нуклеотида в цепи мРНК.
С чем может быть связано отличие митохондриального генетического кода от ядерного? Для нейтрализации АФК в клетке работает несколько ферментов: супероксиддисмутаза (SuperOxide Dismutase (SOD)), каталаза (catalase (CAT)) и глутатионпероксидаза (glutathione peroxidase), а также некторые низкомолекулярные антиоксиданты - витамин С, глутатион, мочевая кислота.
Есть и другие антиоксиданты. Аминокислота метионин в эволюции
накпливается в белках дыхательной цепи митохондрий, т.е. выступает в
качестве естественного антиоксиданта. Для этого митохондрии даже
несколько видоизменили свой генетический код (Bender et al, 2008).

Курсивом выделены отличия от Универсального кода ядерного генома.

В митохондриальном геноме содержится информация о структуре 13-ти белков, в их числе - три субъединицы цитохром-c-оксидазы, цитохром b, субъединица-6 митохондриальной ATP-азы, восемь белков с неизвестной пока функцией. Кроме того, кодируются 12S- и 16S-рРНК, 22 тРНК. Экономичность генома достигается не только благодаря отсутствию интронов в структурных генах, но также и за счет сведения к необходимому минимуму набора тРНК, существенного уменьшения размера рРНК. Кроме того, в человеческой митохондриальной ДНК отсутствуют спейсерные участки, а для множества генов не кодируются даже терминирующие кодоны. Они достраиваются в процессе пост-транскрипционного полиаденилирования соответствующей пре-мРНК.

Как говорилось выше, многие митохондриальные белки кодируются генами ядерного генома, синтезируются в цитоплазме и затем транспортируются в митохондрии. Поэтому мутации, нарушающие функции митохондрий, могут происходить как в митохондриальном, так и в ядерном геномах.

Митохондриальная ДНК, наследуемая только по материнской линии, традиционно используется для эволюционных реконструкций. Так, анализ различий между нуклеотидными последовательностями мтДНК современных людей позволил обосновать мнение о том, что общая праматерь человечества («митохондриальная Ева») проживала в Африке 100-200 тысяч лет назад. Об исследованиях такого рода «Элементы» писали неоднократно, так же как и о трудностях интерпретации получаемых результатов и неоднозначности выводов (см. подборку ссылок внизу). Та же «митохондриальная Ева» была, безусловно, не первой и не последней женщиной, чья кровь течет в жилах всех ныне живущих людей. Тем не менее сравнительный анализ мтДНК остается ценным инструментом для изучения древней человеческой истории наряду с множеством других методов.
Антропологи и генетики из Австралии, Великобритании, Швеции и Швейцарии сообщили в журнале American Journal of Physical Anthropology о новых результатах, полученных в ходе сравнительного анализа последовательностей мтДНК австралийских аборигенов. В дополнение к 20 митохондриальным геномам аборигенов, прочтенным ранее, исследователи определили полные последовательности нуклеотидов мтДНК еще у 8 представителей коренного населения Австралии. Кроме того, использовались неполные последовательности мтДНК 41 аборигена. В исследованную выборку попали жители разных районов Австралии (в том числе и пока неизученных в генетическом отношении).
Имеющиеся у современных людей варианты мтДНК подразделяются на три «макрогруппы»: L1, L2, L3, причем первые две встречаются только в Африке. Макрогруппа L3, в свою очередь, делится на ряд групп. Представители двух из них (M и N) вышли из Африки 60-80 тысяч лет назад и широко расселились по Евразии. Всё современное неафриканское человечество — потомки этих выходцев из Африки (необходимо еще раз подчеркнуть, что здесь очень важна точность формулировок: мы все — действительно их потомки, но это не значит, что мы потомки только этих людей и больше никаких; смешение этих сравнительно поздних выходцев из Африки с более древним евразийским населением отнюдь не исключается результатами анализа мтДНК).

Таким образом, всё неафриканское человечество относится к двум большим «митохондриальным» линиям: M и N, и австралийцы не оказались исключением. Ученые показали, что все известные на сегодняшний день варианты мтДНК австралийцев распадаются на пять групп: AuB, AuA, AuC, AuD, AuE, причем первая группа принадлежит к линии M, а четыре другие — к N. Все пять групп, по-видимому, встречаются только в Австралии, хотя для окончательных выводов изученная выборка слишком мала.

Анализ мтДНК используется не только в популяционных исследованиях. Он используется в криминалистике, для определения родства и др. Анализ мтДНК был использован при исследованиях "екатеринбургских останков", предположительно принадлежащих императору Николаю II и его семье. Т.к. митохондриальный геном наследуется по материнской линии пракически не изменяясь, то можно провести сравнение между предполагаемыми родственниками по материнской линии и определить родство. Анализ проводится в несколько этапов (на примере исследования "екатеринбургских останков"):
1) Выделение ДНК и определение генотипа вариабельных участков митохондриальных ДНК из образцов костной ткани скелета # 4 (фрагмента берцовой кости # 4-46) (Предполагается, что это скелет Николая II).
2) Выделение ДНК и определение генотипа вариабельных участков ДНК из образцов крови Т.Н. Куликовского-Романова.
3) Сравнительное исследование определенных вариабельных участков ДНК образца костной ткани # 4-46 и образцов крови Т.Н. Куликовского-Романова.
4) Определение соответствия или несоответствия предположению о родстве генотипы представленных образцов.
ДНК можно выделять из любых тканей организма, что облегчает исследования.

Митохондриальные заболевания обусловлены генетическими, структурными, биохимическими дефектами митохондрий, приводящими к нарушениям тканевого дыхания. Они передаются только по женской линии, к детям обеих полов, так как сперматозоиды переносят половину геномной информации, а яйцеклетка — поставляет и вторую половину генома, и митохондрии.
Дефект любого из ферментов митохондрий нарушает слаженную работу всей "энергетической станции". При этом в первую очередь страдают наиболее энергозависимые ткани и органы - центральная нервная система, скелетные и сердечная мышцы, почки, печень, эндокринные железы. На фоне хронического дефицита энергии в них рано или поздно возникают патологические изменения и развиваются заболевания, которые получили название митохондриальных. Современной медицине известно около 50 таких болезней. В их клинике встречается самая различная патология, но доминируют поражения центральной нервной системы и мышечной ткани. Симптомами, типичными для митохондриальных заболеваний, являются мышечные боли, слабость и атрофия мускулатуры, непереносимость физических нагрузок, птоз, полинейропатия (невропатия с множественными поражениями), судороги, отсутствие рефлексов, атрофия зрительного нерва, нейросенсорная тугоухость, мигрени, летаргические состояния, изменения психомоторного развития, олигофрения и деменция.

Выделяют 2 группы митохондриальных заболеваний:
1) Наследственные синдромы, обусловленные мутациями генов, ответственных за митохондриальные белки (синдром Барта, синдром Кернса-Сейра, синдром Пирсона, en:MELAS, en:MERRF и др.)
2) «Вторичные митохондриальные заболевания», включающие нарушение клеточного энергообмена как важное звено формирования патогенеза (болезни соединительной ткани, синдром хронической усталости, гликогеноз, кардиомиопатия, мигрень, печеночная недостаточность, панцитопения, а также гипопаратиреоз, диабет, рахит и др.)

Типы митохондриальных заболеваний:
Помимо относительно распространённой митохондриальной миопатии, встречаются:
 - Сахарный диабет, сопровождающийся глухотой (DAD):
Это сочетание в раннем возрасте может быть вызвано митохондриальным заболеванием, но сахарный диабет и глухота могут быть вызваны как митохондриальными заболеваниями, так и иными причинами
 - наследственная оптическая нейропатия Лебера (en:Leber's hereditary optic neuropathy (LHON)), характеризующийся
       потерей зрения в раннем пубертатном периоде;
       синдром Вольфа-Паркинсона-Уайта (en:Wolff-Parkinson-White syndrome)
       рассеянный склероз-подобное заболевание;
 - синдром Ли (Leigh) или подострая склеротическая энцефалопатия:
После начала номального постнатального развития организма болезнь обычно начинается в конце первого года жизни, но иногда проявляется у взрослых. Болезнь сопровождается быстрой потерей функций организма и характеризуется судорогами, нарушенным состоянием сознания, деменцией, остановкой дыхания
 - «Нейропатия, атаксия, retinitis pigmentos и птоз» en:Neuropathy, ataxia, retinitis pigmentosa, and ptosis (NARP): прогрессирующие симптомы нейропатии, атаксии, тунельное зрение и потеря зрения, птоз, деменция;
 - Мускулонейрогенная гастроинтестинальная энцелопатия en:Myoneurogenic gastrointestinal encephalopathy (MNGIE):
гастроинтестинальная псевдообструкция, нейропатия

Для диагностики используются генеалогический, клинический, биохимический, морфологический (биопсия) и генетический анализ.

Особенность многих митохондриальных заболеваний в том, что они могут проявляться неполностью, т.к. в клетке 100-1000 митохондрий, каждая из которых содержит по 2-19 копий мтДНК, и если в каких-то из них произошли мутации, то другие компенсируют функции.

Накопление мутаций в митохондриальной ДНК рассматривается учёными как
один из основных факторов нейродегенеративных заболеваний и старения.
В недавно опубликованной статье Druzhyna NM, Wilson GL и LeDoux SP из Department of Cell Biology and Neuroscience, University of South Alabama приводятся данные о том, что митохондрия имеет свой аппарат репарации повреждений ДНК экзогенными и эндогенными агентами, в роли которых чаще всего выступают свободные радикалы, токсины, лекарства. Большое значение при повреждении мтДНК имеют близость к электрон- транспортной цепи и отсутствие гистонов, защищающих ДНК. Оксидативное повреждение ДНК вызывает изменение оснований, появление AP-сайтов и другие виды повреждения. Наибольший вред наносит 8-оксогуанин, который накапливается в ДНК с возрастом. Повреждение мтДНК гораздо обширнее и сохраняется дольше, чем повреждение ядерной ДНК. Поэтому считалось, что у митохондриальной ДНК нет своей системы репарации или она работает неэффективно, и поврежденные молекулы ДНК разрушаются, а неповрежденные сохраняются как матрица для синтеза новых молекул. Однако исследования показали, что такие повреждения, как дезаминирование, алкилирование и окисление, могут эффективно репарироваться с помощью эксцизионной репарации (BER).
Накопление повреждений ДНК в процессе оксидативного стресса- это основа свободнорадикальной теории старения Хармана (Harman, 2001) . Один из главных источников активных форм кислорода (АФК) в клетке- окислительное фосфорилирование в митохондриях. Поэтому митохондриальную теорию старения можно рассматривать как часть свободнорадикальной. Повреждение мтДНК приводит к усилению синтеза АФК, что в свою очередь может приводить к еще большему повреждению мтДНК- замыкается порочный круг, что в конце концов приводит к смерти клетки.

Многие исследования показали возраст- зависимый характер накопления повреждений мтДНК в скелетных мышцах (Lee et al., 1993), сердечной мышце (Marin-Garcia et al., 2002), мозге (Corral-Debrinski et al., 1992) и печени (Hamilton et al., 2001). Основную роль в повреждении играет 8-оксогуанин (de Souza-Pinto et al.,2001, Hudson et al., 1998). Уровень 8-оксогуанина в мтДНК (но не в ядерной ДНК) и максимальная продолжительность жизни млекопитающих обратно пропорциональны. У медленно стареющих видов млекопитающих уровень 8-оксогуанина ниже, чем у быстро стареющих (Barja and Herrero, 2000). Персистирование поврежденных оснований приводит к повышению частоты мутаций в мтДНК (делеции, дупликации, точковые мутации), которые накапливаются в различных тканях млекопитающих (Khaidakov et al., 2003) и служат причиной недостаточности дыхательной цепи митохондрий. Наиболее изученная возраст-ассоциированная мутация -делеция в положении 4977, также называемая "общей делецией". Также распространены возраст-ассоциированные мутации в Д-петле  (Wei and Lee, 2002). Некоторые из этих возраст-ассоциированных мутаций были обнаружены в тканях людей с митохондриальными заболеваниями. Предполагается, что эти мутации появляются в среднем возрасте и с возрастом накапливаются. Количество поврежденной ДНК в стареющих тканях человека составляет примерно 1%. До сих пор идут дискуссии о том, как такое маленькое количество повреждений может приводить к таким последствиям.
Кроме того, есть данные, что такие мутации обнаруживаются у больных синдромами, связанными с преждевременным старением- пигментная ксеродерма, синдром Дауна, синдром Коккейна и др. (Driggers et al., 1996, Druzhyna et al., 1998, Stevnser et al., 2002a). Возможно, это объясняется низким уровнем оксогуанин-гликозилазы (OGG1) в митохондриях (Szczesny et al., 2004), также наблюдается снижение активности механизмов эксцизионной репарации (в связи с низкой экспрессией OGG1 и ДНК-полимеразы) (Chen et al., 2002).

Мутации в мтДНК играют огромную роль в повреждении таких постмитотичных клеток, как нейроны, и возникновении нейродегенеративных заболеваний. Митохондрии обеспечивают энергию, необходимую для функционирования синапсов, по которым передаются сигналы. Повреждение мтДНК в конечном итоге приводит к нарушению биоэнергетической составляющей нейрона. Нейродегенеративные заболевания характеризуются прогрессирующей гибелью нейронов (апоптозом и некрозом). При нейродегенеративных заболеваниях были обнаружены мутации мтДНК и связанные с ними нарушения биоэнергетики (Kang and Hamasaki, 2005). В мозге обнаруживается повышенное содержание 8-оксогуанина (Bogdanov et al., 2000), о роли которого говорилось выше. Кроме того, при болезни Альцгеймера наблюдается более высокое содержание окисленных оснований в мтДНК, чем в ядерной ДНК, а также снижение активности OGG1. Такие же результаты и при боковом амиотрафическом склерозе и болезни Паркинсона.
Исследования не показали различия в повреждении нейронов и глии. Но исследования культур тканей показали различия между системами репарации в глии и нейронах, кроме того в олигодендроцитах и микроглии эта способность ниже, чем в астроцитах (LeDoux et al., 1998). Кроме того, повреждение ДНК приводит к инициации апоптоза, а в результате- гибель клеток и нейродегенеративное заболевание.

Более 50 лет назад было высказано предположение, что нарушения функционирования митохондрий имеют значение в канцерогенезе (Warburg, 1956). Митохондриальные мутации часто обнаруживают в опухолевых клетках, но не в окружающих тканях. Чаще всего встречаются:
 - замены оснований
 - мутации белок-кодирующих частей митохондриального генома
 - мутации в области Д-петли
 - природные мутации всего хондриома
Чаще всего встречаются делеции и инсерции.
Было показано, что мутации в некоторых сайтах на мтДНК способствуют росту опухоли и снижению апоптоза (Shidara et al., 2005). Кроме того, в опухолевых клетках снижен синтез OGG1, что снижает репарационные способности клетки (Mambo et al., 2005). Сейчас в этой области ведется много исследований: с одной стороны ученые пытаются найти способ усилить оксидативный стресс в опухолевой клетке, а сдругой- усилить экспрессию элементов системы репарации, в том числе OGG1.

В 2003 году в журнале Ageing Cell вышла статья Speakman JR из University of Aberdeen, в которой говорилось о том, что породы собак с более быстрым метаболизмом живут дольше на 30%, чем с медленным. Если это верно и для людей, то люди с быстрым метаболизмом могут жить на 27 лет дольше, по сравнению со средним в мире возрастом 70 лет. Животные с быстрым метаболизмом по сути умирают молодыми. Секрет заключен в митохондрии, от которой в основном и зависит наш метаболизм. Но автор заметил, что необходимы новые исследования, которыми сейчас он и занимается.

Резюмируя все вышесказанное, хочется заметить одно- митохондриальный геном таит в себе еще много загадок, но несомненно, что роль его повреждений в старении, канцерогенезе и возникновении возраст-зависимых заболеваний огромна. По всему миру ведутся исследования, потому что научное сообщество осознает важность и необходимость изучения этой проблемы. Нужно выделить несколько направлений исследований:
1) Роль мутаций в мтДНК в старении.

2) Исследование возможности участия мутации в мтДНК в старении каким-то иным, не связанным с оксидативным стрессом, способом.

3) Исследование связи изменений митохондриального генома с возраст-ассоциированными заболеваниями.

4) Исследование связи изменений митохондриального генома с онкологическими заболеваниями.

5) Поиск мишеней для терапевтического воздействия в борьбе со старением.
Как отмечалось выше, возможно благодаря этим разработкам появятся новые лекарства для онкологических больных, а возможно через некотрое время с их помощью можно будет бороться с механизмом старения.

15 октября 2008 года