2
5100

Возможности коррекции генов, связанных со старением

Компас посвящён возможностям применения генной терапии для борьбы со старением

на сайте с 31 января 2009
Процесс старения, как известно, определяется множеством факторов, как внешних, так и внутренних. Значительную роль при этом играют генетические особенности человека. Описано, например, много заболеваний, так называемых прогерий, при которых старение происходит очень быстро (в отдельных случаях за несколько лет) благодаря наличию специфических мутаций. Эти мутации приводят к определённым дефектам на клеточном и молекулярном уровне, которые резко ускоряют старение всего организма. Прогерии относятся к наследственным заболеваниям, хотя во многих случая у больного просто нет шансов дожить до репродуктивного возраста.


Мутации, приводящие к прогериям, затрагивают такие существенно важные для клетки гены, как гены хеликазы, ламинов, гены систем репарации ДНК.

Прогерии встречаются в популяции достаточно редко. Однако они имеют большое значение для научного понимания того факта, что конкретные мутации могут приводить к процессам старения. Очевидно, что другие, не столь драматические дефекты, тоже способны влиять на старение организма, ускорять или напротив, замедлять его.

Исследования прогерий.

Уже сейчас выделено большое число генов, которые оказывают влияние на ход старения. Это, в частности, ген теломеразы, поддерживающей определённую длину хромосом, гены p53 и p16, контролирующие апоптоз и пролиферацию (в том числе препятствующие пролиферации раковых клеток). В различных опытах на животных и в культурах клеток было показано, что определённые характеристики этих белков связаны со старением. Такими характеристиками могут быть:
     
1.Уровень экспрессии гена и количество соответствующего белка
     
2. Модификации белка (например, фосфорилирование по определённым аминокислотным остаткам), регулирующие его активность
        
3. Регуляция синтеза белка во времени (например, на определённых стадиях клеточного цикла) и пространстве (ткань-специфический синтез)

Регуляция экспрессии генов представляет собой сложный процесс: транскрипция, как и все последующие стадии, контролируется разнообразными способами. Таким образом, на активность генов, связанных непосредственно с процессами старения, влияют гены транскрипционных факторов, регуляторные РНК, регуляторы трансляции РНК и т.д. Несмотря на то, что складывающаяся картина очень сложна, существует принципиальная возможность учесть все значимые
взаимодействия и понять, как на основе активности отдельных молекул формируется процесс нормального функционирования организма, и каким образом он нарушается при старении.


Остановимся на вопросе о том, какой вклад вносит в данный процесс генетический полиморфизм ДНК. Несмотря на большую роль системных взаимодействий, именно последовательность ДНК является базовым уровнем хранения информации. При этом надо понимать, что информации, записанная в ДНК, может контролироваться самыми различными способами. Так, метилирование может отключить экспрессию гена. Модификации гистонов в районе данного гена могут позволять ему экспрессироваться только в определённых тканях и в определённые периоды времени. Таким образом, для понимания механизмов старения и возможностей борьбы со старением имеют значение следующие вопросы:
       
1. Какие именно варианты последовательности ДНК формируют те или иные характеристики белков, вовлечённых в старение? Какие варианты ассоциированы с фенотипами, соответствующими быстрому старению?
       
2. Какие эпигенетические взаимодействия (метилирование ДНК, модификации гистонов) запускают процессы, относящиеся к старению на клеточном уровне?

3. Какие регуляторные факторы (факторы альтернативного сплайсинга, активаторы и ингибиторы ферментов) оказывают влияние на гены, связанные со старением?

Поскольку активность регуляторных факторов также зависит от последовательностей ДНК, кодирующих соответствующие гены, то, манипулируя ДНК, теоретически можно добиться изменения системы в целом.

Первоочередное значение имеет вопрос о том, как именно можно модифицировать ДНК человека, если предположить, что нам уже известны конкретные локусы, которые необходимо изменять. Поиск подобных локусов представляет собой классическую задачу генетического анализа ассоциации. Например, обнаружены полиморфизмы гена интерлейкина 1B, ассоциированные с ранним проявлением болезни Альцгеймера. В работе Катрины Лунетта и соавторов с помощью генотипирования на микрочипах была обнаружена ассоциация продолжительности жизни с генами FOXO1A, GAPDH, KL, LEPR, PON1, PSEN1, SOD2, и WRN. Один из аллелей гена ApoE (эпсилон4) ассоциирован с той же болезнью Альцгеймера. Полиморфизм rs2811712 гена p16 ассоциирован с физическим функционирование пожилых людей. Подобные результаты сильно зависят от возможной стратификации (на состав контрольной и опытной выборок, которые изучаются в конкретной работе, может влиять этнический
состав участников и т.п.) и поэтому нуждаются в проверке.


Больший практический интерес представляют исследования полиморфных маркеров, которые изменяют определённые функции самих белков, важные для активности последних. Информация о них может быть гораздо более полезной при реконструкции системы взаимодействий, приводящих к старению.
Например, аминокислотная замена Arg72Pro в гене p53 усиливает апоптотические функции белка и при этом ассоциирована с продолжительностью жизни.


Поиск генов, ответственных за старение человека, а также соответствующих изменений экспрессии генов, ведётся во многих лабораториях, в частности в группе Брюса Янкнера из Медицинской школы Гарварда, и Леонарда Гуаренте из М.И.Т.

Коррекция последовательности ДНК в тканях

Коррекции ДНК можно достичь, заменяя вариант, уже присутствующий в тканях пациента, на другой, экзогенного происхождения, обладающий желаемыми свойствами. Либо, при отсутствии в геноме реципиента нужной последовательности, она может быть встроена в заранее выбранный локус.

Методы введения определённых последовательностей ДНК в отдельные клетки разрабатываются уже давно и стали неотъемлемой частью методов молекулярной биологии. В клетки бактерий ДНК вводится в форме плазмид, в клетки эукариот – с помощью плазмид и других векторов в комплексе с липидами, облегчающими проникновение вектора. Применяются такие методики как электропорация или трансформация с помощью вирусных векторов.

Однако, существуют очевидные и глубокие различия между доставкой генетического материалы в отдельные клетки, выращиваемые в искусственной среде, и доставкой того же материала в ткани многоклеточного организма. Задача по введению ДНК в отдельные клетки облегчается возможностью проведения селекции. А именно, вместе с целевым геном в вектор встраивается последовательность, обеспечивающая, например, устойчивость к антибиотику, с помощью которого в дальнейшем проводится селекция. Эффективность трансфекции можно также проверять, вставляя в вектор последовательности, кодирующие флуоресцентные белки.

К вектору, который можно было бы применять для доставки необходимой ДНК, например, в нейроны головного мозга, предъявляются гораздо более высокие требования. Он должен обеспечивать эффективную трансформацию, не обладать какой-либо токсичностью и не повреждать последовательности других генов клеток. 

Наибольшей эффективностью трансформации обладают векторы,
спроектированные на основе вирусов. В течение своей эволюции вирусы уже выработали эффективные приспособления для проникновения в клетку-хозяина и встраивания своей ДНК в её геном, если речь идёт об интегрирующихся вирусах. При дизайне векторов используются вирусные варианты, неспособные размножатся в клетке, то есть несущие только те гены, которые необходимы им для проникновения через мембрану и экспрессии переносимой последовательности. Однако, необходимо учитывать, что вирусные геномы могут перестраиваться с течением времени, а также использовать ферменты, кодируемые другими вирусами, для размножения. 

Среди ограничений подобных методик надо учитывать максимальный размер генетической последовательности, которую можно вставить в вирусный геном, а также возможность иммунного ответа организма на вектор, который может быть распознан лимфоцитами как обычный вирус.  Большая часть используемых в настоящее время вирусных векторов создана на основе ретровирусов и аденовирусов. Однако (преимущественно в научных исследованиях) применяются и другие вирусы, такие как поксвирусы, Эпштейн-Барр, бакуловирусы и т.п.


 Ретровирусные векторы

Ретровирусы содержат РНК в качестве генетического материала. При заражении клетки на матрице вирусной РНК с помощью обратной транскриптазы  (ревертазы) синтезируется её ДНК копия, которая впоследствии встраивается в геном с помощью другого вирусного фермента – интегразы. При использовании в качестве векторов ретровирусы имеют серьёзный недостаток – неспецифичность интеграции. Встраиваемая последовательность может оказаться внутри последовательности любого гена клетки-хозяина и таким образом нарушить его функцию. Одной из разновидностей ретровирусов являются лентивирусы. Их основное преимущество в качестве векторов состоит в способность заражать
неделящиеся клетки.


Ретровирусные векторы успешно применялись для лечения X-SCID - Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита и ADA-SCID – иммунодефицита, вызванного дефицитом аденозиндезаминазы. Начиная с 1990 года было вылечено 17 человек, однако данная работа была приостановлена, когда выяснилось, что у 4 пациентов возникла лейкемия. Предположительно, рак был вызван нарушением функции генов-онкосупрессоров в результате случайной интеграции (инсерционного мутагенеза). Однако, возможно, что причиной послужила экспрессия (под контролем вирусного промотора) гена gamma c, который вводился больным с X-SCID. 

Аденовирусные векторы

В качестве генетического материала используют двуцепочечную ДНК. Вирусная ДНК не встраивается в геном клетки, что исключает возможность инсерционного мутагенеза. 

Модификации аденовирусов позволяют удалять из их генома почти всю вирусную ДНК (оставляя лишь участок, необходимый для упаковки ДНК в вирион) и заменять её на предназначенные для встраивания последовательности.

Аденовирусные векторы успешно применялись в экспериментах на клеточных линиях для доставки гена p53 в лишённые его раковые клетки. Экзогенный p53 восстанавливал способность клеток к апоптозу, а также предотвращал рост опухолей на животных моделях.

Один из наиболее эффективных методов, разработанных на основе аденовирусных векторов, получил название Suicide Gene Therapy («самоубийственная генная терапия»). Раковые клетки трансформируются вектором, несущим ген тимидинкиназы, который кодирует фермент, превращающий препарат ганцикловир в токсичное вещество. Однако, клинические испытания показали, что существующие векторы ещё достаточно токсичны.

Отдельное перспективное направление представляет собой генетическая инженерия эмбрионов на ранних стадиях развития, либо коррекция генетического материала ещё на стадиях оплодотворённой яйцеклетки или половых клеток. В этом случае исключаются сложности, связанные с доставкой генетического
материала во взрослый организм. Однако, как и всегда при работе с человеческими эмбрионами, возникает много этических аспектов. Работа по введению гена зелёного флуоресцентного белка в эмбрион человека, проведённая в Корнельском университете, вызвала громкую критику. Необходимо быть уверенным, что намеченная модификация не принесёт никакого вреда будущему ребёнку.

В настоящее время подобные работы запрещены в большинстве стран мира по этическим мотивам. В упомянутом исследовании, по утверждению авторов, ген флуоресцентного белка был введён в заведомо нежизнеспособный эмбрион. Однако, если подобные технологии покажут свою безопасность и эффективность, их можно будет использовать для исправления целого ряда наследственных заболеваний – результат будет распространяться и на потомков этих детей.

Европейское сообщество генной и клеточной терапии

Подробную информацию о ведущихся и завершённых клинических исследования в области генной терапии можно найти на сайте Журнала генной медицины.


Ткань-специфическая коррекция активности генов с помощью вирусных векторов

Общий подход для достижения ткань-специфической активности экзогенных последовательностей заключается в использовании соответствующих ткань-специфических промоторов. Например, в вирусном векторе естественный вирусный промотор заменяется на определённый промотор организма-хозяина. Причём транскрипционный фактор, связывающийся с данным промотором, присутствует только в определённых тканях (в тех, где необходимо провести коррекцию экспрессии).

В частности, для борьбы с раком, поражающим альвеолярные и бронхиальные эпителиальные клетки, был разработан аденовирусный вектор, в котором промотор Е4 был заменён на человеческий промотор SPB, активирующийся только в эпителии. Для лечения раковых метастаз в костной ткани был предложенвектор, содержащий промотор остеокальцина.

Другой источник специфичности заключается в характере взаимодействий вириона с оболочкой хозяйской клетки. Большинство вирусов заражают только определённые типы клеток. Белки, находящиеся на поверхности вириона, взаимодействуют с клеточными белками и олигосахаридами. Специфические клеточные белки, например, рецепторы, запускают структурные изменения в вирусной оболочке и активирует проникновение внутрь клетки.

Меняя состав оболочки вириона или упаковывая вирусную ДНК в оболочку другого, более или менее специфичного вируса, потенциально можно добиться доставки только в определённую ткань. С помощью подобной технологии был разработан лентивирусный вектор, с высокой специфичностью заражающий только клетки, несущие рецептор CD20.

Сайт-специфические нуклеазы

Одним из методов исправления дефектных генов может послужить применение сайт специфических нуклеаз – ферментов, способных вносить двуцепочечные разрывы в ДНК в строго определённом участке. В сочетании с гомологичной рекомбинацией эта методика позволит заменять нежелательную последовательность гена на «здоровую», вносимую с тем же вектором. Любой многоклеточный организм обладает значительным разнообразием транскрипционных факторов, узнающих различные участки ДНК. Владея информацией о том, каким именно образом структуры белковых доменов транскрипционных факторов позволяет им связываться с определёнными ДНК-последовательностями, мы можем создать искусственные ДНК-связывающие домены. Путём соединения таких доменов с изначально неспецифической нуклеазой может быть получен фермент, распознающий, например, определённую мутацию, и вносящий разрыв в данный ген. 


Было предложено использовать домены цинковых пальцев и нуклеазу FokI для создания подобных искусственных рестриктаз.

Zinc finger consortium объединяет исследователей, занятых разработкой нуклеаз с Zinc finger-доменами.
 
Применение РНК-интерференции для регуляции экспрессии

РНК-интерференция – явление, широко распространённое в природе, и служащее как для регуляции количества определённых РНК, так и для устранения вирусных РНК, проникающих в клетки. Суть её заключается в разрушении молекул РНК при участие специальных белковых комплексов, активированных с помощью коротких фрагментов комплементарной РНК (siRNA –короткие интерферирующие РНК). 

После того, как механизм данного явления был установлен, начали разрабатываться методики влияния на состав mRNA клетки с помощью РНК-интерференции. Так, в культивируемые клетки эукариот можно вводить либо готовые siRNA, либо экспрессирующие их векторы для того, чтобы добиться разрушения определённой РНК, синтезируемой в клетке. Подавление экспрессии при этом достигается без какого-либо воздействия непосредственно на последовательность ДНК гена.

Были, в частности, разработаны siRNA для снижения экспрессии гена хантингтина, вызывающего болезнь Хантингтона. Их применение на «мышиной» модели болезни позволило заметно уменьшить симптомы, связанные с нарушением двигательной активности.

В 2004 году начались клинические исследования метода лечения дистрофии жёлтого пятна сетчатки с помощью siRNA.

Журнал RNAi therapy публикует исследования, посвящённые применению технологии РНК-интерференции на многоклеточных организмах.

Воздействие с помощью антисмысловых ДНК – другой вариант использования олигонуклеотидов для выключения экспрессии генов. Предполагается, что комплементарный нуклеотид может связаться со смысловой цепью ДНК и препятствовать транскрипции.


Регуляция экспрессии генов с помощью низкомолекулярных соединений
Известны примеры специфического влияния различных веществ на экспрессии генов. Например, хинидин – алкалоид коры хинного дерева, способен снижать экспрессию транскрипционного фактора c-myc, который вовлечён в процессы регуляции клеточного цикла.

 Влияние на экспрессию может достигаться разнообразными способами. Очевидно, что гормоны, как и агонисты рецепторов, будут запускать в клетках определённые процессы, приводящие к изменению экспрессии генов. В таком случае сложно добиться специфического влияния на тот или иной ген с помощью низкомолекулярных соединений. Однако не исключена возможность, что благодаря специфичному связыванию с определёнными белками, различные химические вещества могут оказывать высокоспецифический эффект. Для поиска таких соединений могут быть проведены фармакологические исследования, направленные на поиск данных веществ с помощью масштабного скрининга.

Выводы

Технологии коррекции последовательностей генов, в том числе связанных со старением, а также технологии коррекции их экспрессии в настоящее время интенсивно развиваются. Важнейшим условием для создания методов коррекции генов в клетках человека является достижение специфичности как на уровне введения векторов в клетки (например, благодаря ткань-специфическим рецепторам), так и на уровне воздействия на конкретный ген либо участок ДНК (например, с помощью искусственных сайт-специфических нуклеаз).

Можно наметить следующие этапы по разработке методов коррекции генов для увеличения продолжительности жизни:

1.      Поиск генетических вариантов, ассоциированных с
долголетием, а также вариантов, ассоциированных с конкретными свойствами регуляторных белков, активность которых обеспечивает долголетие.

2.      Анализ возможных последствий искусственного введения
таких вариантов в организм человека. Необходимо предусмотреть риски, связанные с возможным побочным действием генетического материала и с возможной токсичностью векторов, вероятностью мутагенеза и т.п.

3.     Разработка методов введения данного генетического
материала в организм человека. 

Комментарии

20 августа 2009 в 23:54
 
Возможно ли еще в схемах сделать перевод на русский язык выносных текстов-комментариев? Если есть трудности с внесением этих переводов в графические файлы, то могу оказать помощь.

Оставить комментарий

Поделиться с друзьями

Share on Twitter