Регуляция альтернативного сплайсинга мРНК

Прежде чем говорить об альтернативном сплайсинге
необходимо обсудить что же такое сплайсинг вообще. Для рассмотрения этого вопроса воспользуемся лекциями, представлеными на сайте кафедры химии природных соединений МГУ, в которых это вопрос объясняется довольно подробно.
Сплайсинг- один из этапов созревания мРНК, которое происходит в ядре. Большинство генов эукариот имеет прерывистое строение, т.е. участки, кодирующие мРНК (экзоны), перемежаются с интронами - участками, вырезаемыми из пре-мРНК при сплайсинге. Белковые комплексы, отвечающие за кепирование, сплайсинг и полиаденилирование, взаимодействуют между собой, а также с РНК полимеразой II. Фосфорилированная форма CTD РНК полимеразы II, т.е. форма, характерная для элонгирующей РНК полимеразы, служит площадкой для присоединения аппарата созревания.
 Сплайсинг – это процесс вырезания внутренних участков пре-мРНК, называемых интронами. Бывает несколько разновидностей сплайсинга. Наиболее распространенный тип – это вырезание интронов с помощью малых ядерных РНП (мяРНП). Эти небольшие РНК, связанные с белками имеют ряд особенностей. Их 5’-конец закрыт кепом, причем в отличии от мРНК остаток гуанозина на 5’-конце не моно-, а  триметилирован (по N7 и дважды по N2). Кроме того, мяРНК как правило содержат Sm последовательность, к которой присоединяется набор из семи Sm белков. Эти маркеры мяРНК нужны для направленного транспорта их в ядро и прикрепления к фосфорилированному CTD РНК полимеразы II.

Как белки и РНК, осуществляющие сплайсинг, узнают какой фрагмент пре-мРНК нужно вырезать? И у дрожжей и у высших эукариот есть консервативные последовательности, определяющие 5’ и 3’ границы интронов. Выделяют три функционально важных участка пре-мРНК, участвующие в сплайсинге: 5’-место сплайсинга (5’SS), 3’- место сплайсинга (3’SS) и место разветвления (BS). На первой стадии 2’-гидроксил аденозина места разветвления атакует фосфодиэфирную связь 5’SS. В итоге этой атаки образуется структура “лассо” и свободный 3’-гидроксил 5’-концевого экзона. Во время второй стадии этот 3’-гидроксил атакует 3’SS. В результате экзоны оказываются ковалентно соединенными обычной межнуклеотидной связью, а интрон уходит в виде структуры “лассо”.
 Как же и в какой последовательности узнаются места сплайсинга и разветвления? Сначала U1 мяРНП узнает 5’-место сплайсинга, а возможно и 3’-место сплайсинга. Место разветвления узнается белком SF1, а полипиримидиновая последовательность, предшествующая 3'SS - гетеродимером U2AF. При этом образуется комплекс CC (commitment complex) – комплекс определяущий вырезание данного интрона.

  На следующем этапе комплекс CC переходит в комплекс A. Белок SF1 вытесняется с помощью UAP56 и с местом разветвления связывается U2 мяРНП. В самом U2 мяРНП фрагмент U2 мяРНК, комплементарный BS, освобождается от белка SAP61. Связыванию U2 РНП помогает белок U2AF.

 После связывания U2 мяРНП к сплайсосоме (т.е. комплексу, осуществляющему сплайсинг) присоединяется крупный рибонуклеопротеид, содержащий 3 мяРНК: U4,U5 и U6. В результате образуется комплекс B1, содержащий 5 молекул мяРНК. U1 мяРНК в этом комплексе связана с 5’SS, U2 – с местом разветвления, а U4 мяРНК связана с U6 многочисленными комплементарными взаимодействиями. Все мяРНК, кроме U6 синтезируются РНК полимеразой II и имеют классические атрибуты мяРНП – связанные Sm белки и триметилированный кеп. U6 мяРНК транскрибируется РНК полимеразой III и не имеет кеп-структуры. Кроме того, вместо Sm белков с ней связаны гомологичные им Lsm белки.

После образования B1 комплекса происходит самая драматическая конформационная перестройка сплайсосомы . Во-первых, теряется связь U1 мяРНК с 5'SS. Во-вторых, расплетается дуплекс между U4 и U6 мяРНК. В-третьих, образуются дуплексы между U6 мяРНК и 5’SS, а также U6 и U2 мяРНК. Самую активную роль в этих перестройках играют белки, ассоциированные с U5 мяРНК. U5-200k расплетает дуплекс между U4 и U6 мяРНК, а U5-100k помогает образовать контакт между U6 и 5’SS. Другой белок, ассоциированный с U5 (U5-220k) способствует тому, что консервативная шпилька U5 мяРНК связывает 5’SS и 3’SS. В результате оказывается, что дуплекс U2 и U6 связывает место разветвления и 5'-место сплайсинга. U5 мяРНК дополнительно фиксирует 5’SS так, что оказывается возможным провести нуклеофильныю атаку 2’-OH выпетливающегося аденозина на межнуклеотидную связь 5’SS.

 Переход от B2 комплекса к C1 как раз соответствует первой стадии сплайсинга, т.е. образованием лассообразной структуры и освобождению 3’-гидроксила 5’-концевого экзона. В самом каталитическом акте сплайсосомы принимают участие белки Spp2p и Prp2p, хотя основную роль в катализе играют не белки, а сплайсосомная РНК.
После прохождения первой стадии сплайсинга необходимо подставить в активный центр сплайсосомы 3’SS. За выбор 3’-места сплайсинга отвечает U5-220k белок. Целый ряд белковых факторов играют роль в подстановке 3’-места сплайсинга в активный центр. Кроме того, осуществляется контроль за правильностью проведения первой стадии сплайсинга в котором принимает участие белок Prp16p.



 Особую роль в позиционировании 5’-экзона и 3'-места сплайсинга играет консервативная шпилька U5 мяРНК. Кроме того, первый и последний нуклеотиды интрона образуют неканоническую G-G пару. Вторая стадия сплайсинга, катализируемая сплайсосомой заключается в атаке 3’-гидроксила первого экзона на межнуклеотидную связь между интроном и 3’-концевым экзоном. В результате экзоны оказываются соединенными, а интрон – вырезанным в виде лассообразной структуры.

После прохождения обеих стадий сплайсинга становится необходимо разобрать сплайсосому, освободить лигированные (сшитые) экзоны, а также вырезанный интрон. мРНК высвобождает HRH1 белок. Разборкой сплайсосомы занимается белок mDEAH9. Дополнительный белковый фактор (Prp24p) нужен для воссоздания U4/U6 гетеродимера. Не все белки, входящие в состав сплайсосомы, покидают мРНК после сплайсинга. Некоторые остаются связанными с мРНК в ядре и участвуют в экспорте сплайсированной мРНК. Другие переносятся с мРНК в цитоплазму, где осуществляют “контроль качества” мРНК при ее трансляции.
Схематично цикл работы сплайсосомы можно представить так:

Молекулярный каскад, задействованный в процессе сплайсинга очень сложен. Множество белковых факторов, вступающих в сложное взаимодействие. Рассмотрим этот процесс в динамике.

Альтернативный сплайсинг- это образование разных мРНК из одной и той же пре-мРНК, синтезированной с одного гена. Это достигается благодаря комбинированию порядка и количества экзонов.
С одного и того же гена синтезируются разные белки. Это явление ткане-специфично и зависит от стадии клеточного цикла. Рассмотрим конкретный пример- тропомиозин, белок, участвующий в мышечном сокращении. В разных клетках с гена тропомиозина синтезируются разные белки:

Альтернативный сплайсинг позволяет индивидуальным генам продуцировать множественные изоформы белков - играя тем самым центральную роль в генерации сложных протеомов. Альтернативный сплайсинг кроме того имеет в основном скрытую функцию по количественному генному контролю путём направления РНК на nonsense-обусловленный распад.
Механизмы альтернативного сплайсинга традиционно изучались с использованием индивидуальных модельных систем, но эти подходы сегодня завершены глобальным анализом. Регуляция сплайсинга как правило осуществляется с помощью модуляции ранних ступеней сборки сплайсосомы. Цис-элементы представляют собой энхансеры и сайленсеры сплайсинга, которые могут быть локализованы или в экзонах или в интронах и которые связывают активаторные и репрессорные белки.
Согласно Arianne J. Matlin из Кэмбриджского Университета, иногда присутствие или отсутствие одиночного регулятора достаточно, чтобы предопределить пути альтернативного сплайсинга. Наиболее распространено, комбинации наиболее широко распространённых факторов вовлекаются в выбор путей сплайсинга. Это привело к концепции 'cellular codes', которые составляются за счёт определенных комбинаций регуляторных факторов.

А Регуляторные элементы взаимодействуют со специфическими сайтами. Элементы подразделяются на экзонные энхансеры (exon splicing enhancers, ESEs) и сайленсеры сплайсинга (exon splicing silencers, ESSs) и интронные энхансеры (intron splicing enhancers,ISEs) и сайленсеры (intron splicing silencers, ISSs). Энхансер активирует рядом расположенные сайты сплайсинга или противодействует сайленсерам, сайленсеры могут репрессировать сайты сплайсинга или энхансеры. Включение или пропуск экзона определяется соотношением этих факторов, которое в свою очередь может определяется отношением концентраций родственных РНК-связывающих белков-активаторов или репрессоров. B Элементарный акт сплайсинга представляет собой бинарный выбор. Ba Группа экзонов представляет собой отдельный элемент, который может быть независимо вставлен или вырезан из мРНК. Далее они могут быть подразделены на "пропускаемые" или "скрытые" экзоны соответственно тому включается или вырезаются экзоны. Bb Сплайсинг включает выбор только одного из множества вариантов. Bc,d Конкуренция 3' и 5'-сайтов представляет "модификацию экзонов". Be удерживание интронов. Bf альтернативный сплайсинг с использованием альтернативных промоторов или Bg 3'-сайтов процессинга.
Механизм действия энхансеров и сайленсеров на примере определения пола у дрозофилы:

A Модель функционирования экзонного энхансера (ESE). Белок SR (SRp), связываясь с ESE, может активировать сплайсинг, активируя U2AF65, который ослабляет полипиримидин SRm160 (оранжевая стрелка), или с помощью взаимодействия с RNA branch point (голубая стрелка). В Слабый 5'-сайт сплайсинга усиливается связыванием TIA1 с нижележащим интронным энхансером (ISE). TIA1 активирует пол-зависимый tra 3'-сайт с помощью вовлечения SXL, взаимодействующего с интронный сайленсером ISS, встроенным в полипиримидиновый участок, и предотвращения связывания U2AF. Это приводит к выбору нижележащего специфичного для женской особи сайта. D Вставка экзона 3 HIV1 tat пре-мРНК определяется ядерным соотношением специфических гетерогенных ядерных рибонуллеопротеинов (hnRNP) и SR белка. Мультимеризация hnRNPA1 в незрелой особи с высоко-афинного ESS блокируется взаимодействием SF2/ASF с вышележащим ESE. Поэтому ESE необходим RRM-домен, а не RS-домен SF2/ASF. Е Регуляция сплайсинга экзона N1 в src-транскрипте представляет собой пример комбинаторного контроля взаимодействия и антагонизма позитивных и негативных факторов. Не в нервных клетках (слева) N1 вырезан, в нейронах (справа) он включен в зрелую мРНК.

Все эти сложные каскады, взаимодействие регуляторных белков и т.д. приводит к тому, что в разных клетках содержатся разные изоформы белков.

В Лаборатории канцерогенеза человека Center for Cancer Research, National Cancer Institute под руководством Curtis C. Harris проведены исследования белков, защищающих теломеры (Protection of telomeres 1 (POT1) proteins). Эти исследования необычайно важны для решения проблемы старения, т.к. именно с укорочением теломер связана одна из теорий старения. У человека, в отличие от традиционного обекта исследований-мышей, всего один ген POT1. Кроме основного длинного варианта POT1 (вариант1), благодаря альтернативному сплайсингу существуютдругие варианты (варианты 2-5), функционирование которых еще не исследовано в полной мере. Анализ вариантов POT1, усеченных с N- и С-конца, показал, что ни способность связывания с теломерами N-концевого связывающего нуклеотида (OB), ни теломеразо-зависимая элонгация теломер не зависят от С-концевого TPP1-взаимодействующего домена. Важно, что вариант 5, усеченный с С-конца, который содержит N-концевое OB кольцо и центральный регион с неясной функцией, защищает теломеры и предотвращает клеточное старение, так же как и длинный вариант 1. В данном исследовании показано, что:
 1) вариант 1 (но не вариант 5) поддерживает 3'-концевую избыточность теломер
 2) p53 необходим для старения, индуцированного выключением варианта 5
 3) вариант 5 функционирует только на обломках ДНК для предотвращения запуска сигналлинга повреждения ДНК
Кроме того, вариант 5 чаще всего экспрессируется в опухолевых клетках, участвует в поддержании стабильности хромосом при дефиците mismatch репарации.

В другой лаборатории этого центра- Лаборатории Молекулярной Фармакологии-под руководством Yves Pommier проведена работа по исследованию митохондриальной топоизомеразы (TOP1mt), активность которой необходима для репликации, транскрипции и репарации митохондриальной ДНК.
Митохондриальные заболевания, связанные с нарушениями митохондриального генома, включают нейродегенеративные заболевания, метаболические нарушения и преждевременное старение. Выяснено, что пре-мРНК, синтезированная с гена TOP1mt, подвергается альтернативному сплайсингу, в результате которого синтезируются различные изоформы фермента. Исследования будут продолжены, т.к. проблема представляет собой несомненный интерес для научной общественности и может иметь практическое значение.

Dean Tang из Департамента Канцерогенеза The University of Texas MD Anderson Cancer Center были проведены исследования 15-липоксигеназы-2 (15-LOX2)- липоксигеназы, экспрессирующейся в зрелых клетках простаты. Ее экспрессия снижается или полностью отсутствует при неоплазии ткани простаты и раке простаты. В ходе исследований выяснено, что пре-мРНК 15-LOX2 подвергается альтернативному сплайсингу, в результате чего синтезируются разные изоформы, которые являются негативными регуляторами клеточного цикла в нормальных эпителиальных клетках простаты. 15-LOX2 является важным фактором в дифференцировке клеток. Ее индукция связана с клеточным старением. Она является супрессором опухолевого роста. Вероятно, различные изоформы этого белка, так или иначе участвуют в развитии опухоли простаты.

Ученые из Университета Калифорнии исследовали транскрипционный фактор TBX3. Было обнаружено, что TBX3 может сделать мышиный эмбриональный фибробласт (MEF) бессмертным. Аналог TBX3, TBX2, предотвращает старение в клетках грызунов и экспрессируется в некоторых видах рака груди человека. Предполагается, что TBX3 также может иметь значение при раке груди.
Пре-мРНК TBX3 подвергается альтернативному сплайсингу в результате чего образуются разные изоформы, в том числе TBX3 + 2a, которая отличается от основной формы наличием 20 дополнительных аминокислот в ДНК-связывающем домене. TBX3 и TBX3 + 2a экспрессируется в организме повсеместно, но альтернативный сплайсинг ткане-специфичен. Как говорилось выше, гиперэкспрессия TBX3 способна сделать MEF бессмертными, в то время как TBX3 + 2a вызывает ускорение старения, это может быть объяснено тем, что разные изоформы воздействуют на разные мишени. В культурах клеток рака груди наблюдается гиперэкспрессия TBX3. Рак груди -одно из опаснейших возрастзависимых заболеваний и его исследования несомненно принесут пользу.

Как видно из приведенных примеров, исследования альтернативного сплайсинга в аспекте проблемы старения и возраст-ассоциированных заболеваний необходимы. Синтез различных изоформ приводит к изменению в дифференцировке, пролиферации и функционировании клеток. Необходимы детальные исследования:
1) регуляторных элементов, влияющих на альтернативный сплайсинг, и возможностей воздействия на них
2) альтернативного сплайсинга пре-мРНК, с которых синтезируются различные регуляторные белки (например, транскрипционные факторы)
3) роль альтернативного сплайсинга в канцерогенезе
4) роль альтернативного сплайсинга в процессе старения
5) возможности регуляции альтернативного сплайсинга и мн. др.

3 октября 2008 года