Регуляторы альтернативного полиаденилирования мРНК

Полиаденилирование- присоединение аденина к 3'-концу мРНК- это один из вариантов посттранскрипционного процессинга (модификации) мРНК, играющий значение, в том числе и в регуляции экспрессии генов. Процессинг 3'-конца является важным этапом в созревании мРНК у всех эукариот. Полиаденилирование необходимо для терминации транскрипции, для транспорта мРНК из ядра, стабильности (защищает мРНК от деградации нуклеазами) и инициации трансляции.
Полиаденилирование- двухэтапная реакция:
1)сайт-специфичное разрезание пре-мРНК
2)синтез поли-А хвоста определенной длины на 3'-конце порезанного продукта

Эта реакция нуждается в присутствии цис-активных сигнальных последовательностей в нетранслируемом регионе пре-мРНК, также как и в присутствии транс-активных белковых факторов. Возможность разделения двух этапов этой реакции сделала возможной биохимическую идентификацию факторов, вовлеченных в каждый из этапов.

Чуть выше говорилось, что синтезируется поли(А) хвост определенной длины (в среднем 150 нуклеотидов). Это очень важный вопрос. Длина хвоста определяет период жизни мРНК. Дело в том, что поли(А) хвост постепенно "откусывается" ферментом, названным DAN. Таким образом хвост защищает саму мРНК от деградации. В некоторых клетках хвост постоянно ресинтезируется, что значительно увеличивает период жизни мРНК, такой механизм есть в ооцитах (яйцеклетках). А некоторые мРНК, например те, которые кодируют гистоновые белки, не имеют поли(А) хвоста, поэтому их период жизни значительно меньше (приблизительно 1 час). Вместо поли(А) хвоста гистоновая мРНК защищена с помощью образования петли (stem-loop) на 3'-конце.

Таким образом, после полиаденилирования мРНК имеет такую структуру:

Как говорилось выше, полиаденилирование состоит из двух этапов- разрезания пре-мРНК и построение поли(А)-хвоста. Рассмотрим факторы, участвующие в этих процессах.
Для разрезания необходимы cleavage/polyadenylation factor I (CPSF) (фактор разрезания/полиаденилирования) и Cleavage factor II (CF II), а для достраивания необходимы поли(А)-полимераза (poly(A) polymerase (Pap1)), cleavage factor I (CF I), polyadenylation factor I (PF I) и Pab1 или Nab2 (См. схему). CF II, Pap1, и PF I могут быть выделены как один большой комплекс CPF. С помощью комбинирования биохимических и генетических методов были идентифицированы все гены, вовлеченные в этот процесс.
Механизм:
Мультибелковый комплекс обеспечивает разрезание пре-мРНК на 15-30 нуклеотидов дальше сайта, распознаваемого CPSF. Чаще всего сайт содержит  AAUAAA-последовательность, но возможны другие варианты, но связывание CPSF слабее. CstF (cleavage stimulation factor, фактор стимуляции разрезания) связывается c GU-богатым регионом дальше сайта. С третьим сайтом распознавания, содержащим UGUAA-последовательность, связывается CFI, что активирует CPSF даже если он не связался с AAUAAA. РНК нарезается сразу после транскрипции, как только CstF связывается с РНК-полимеразой II. Кроме того, в разрезании участвует CFII, но детали пока неизвестны.

Когда закончено разрезание, начинается полиаденилирование с помощью PAP. Она присоединяет к 3'-концу РНК АМФ (аденозин монофосфат) от АТФ , отщепляя пирофосфат. PAB2 связывается с новым коротким поли(А)-хвостом и увеличивает аффинность PAP к РНК. Когда хвост достигает длины примерно 250 нуклеотидов, фермент теряет связь с  CPSF и полиаденилирование останавливается.  CPSF контактирует с РНК-полимеразой II и останавливает транскрипцию. Кроме того, мультибелковый комплекс связываетсячерез CFI  со сплайсосомой, которая удаляет из РНК интроны.
Эту схему можно представить подробнее:

Немного подробнее рассмотрим PAP, которая, по выражению профессора Claire Moore из Бостонского Tufts University, является своеобразным "сердцем" этой молекулярной машины. Исследования Claire Moore и Andrew Bohm  показали, что PAP состоит из 3 доменов по 150-200 аминокислотных остатков каждый. N-концевой домен принадлежит к семейству нуклеотидил трансфераз и содержит характерную триаду аминокислот. Эти аминокислоты участвуют в метал-регулируемом связывании фосфатной группы  АТФ, и способны к позиционированию нуклеофильной 3'-OH (гидроксо-группы) праймера, что облегчает реакцию, катализируемую нуклеотидил-трансферазой.
Средний домен PAP не имеет какой-либо структурной гомологии с другими белками. Исследования показали, что он участвует во взаимодействии с фосфатной группой АТФ и удалении пирофосфата, а также в транслокации РНК для следующего этапа полиаденилирования.
C-концевой домен необходим для удерживания поли(А)- праймера на месте.

Около половины генов, кодирующих белок, обладают более, чем одним сайтом полиаденилирования. Таким образом, ген кодирует несколько мРНК, которые отличаются по 3' концу. Кроме того, альтенативное полиаденилирование изменяет длину 3'-нетранслируемого региона, это может сказаться на сайтах связывания для microRNA, содержащихся в 3'-нетранслируемой области. microRNA подавляют трансляцию и запускают деградацию мРНК, с которой связываются. Альтернативное полиаденилирование может укоротить кодирующую область мРНК, следовательно синтезируется другой пептид, короче исходной последовательности, хотя это встречается реже, чем укорочение 3'-нетранслируемого региона.
Выбор сайта полиаденилирования происходит в зависимости от белков, участвующих в нем. Например, экспрессия CstF-64, субъединицы CstF, повышается в макрофагах в ответ на липосахариды (компонент бактериальной стенки, который инициирует иммунный ответ). Это результат выбора слабых поли(А)-сайтов и соответственно синтеза коротких транскриптов, устранению регуляторных элементов в 3'-нетранслируемой области мРНК таких компонентов защиты, как лизоцим и TNF-α. Эти мРНК имеют большую продолжительность жизни.

Альтернативное полиаденилирование для одного и того же гена носит ткане-специфичный характер, более того, оно изменяется в течение жизни клетки. Согласно исследованиям ученых из University of Medicine and Dentistry of New Jersey  можно выделить 42 отдельных типа альтернативного полиаденилирования. Было обнаружено, что в некоторых тканях используются сайты полиаденилирования, имеющие определенную локализацию в гене, например, сайты локализующиеся в интронах или внутренних экзонах и различные сайты в экзоне, локализованные близко к 3'-концу. Также были обнаружены ткани (ткани глаза, сетчатка, плацента), которые используют сайты, редко использующиеся в других тканях. Было проанализировано около 20 генов, белковые продукты которых участвуют в регуляции полиаденилирования. Некоторые ткани мозга демонстрируют высокий уровень соответствия экспрессии этих генов, но низкий уровень соответствия другим тканям. При сравнении областей генома, окружающих поли(А)-сайты, использующиеся в основном в тканях мозга, с областями в других тканях, были идентифицированы некоторые цис-регуляторные последовательности, специфически ассоциированные с поли(А)-сайтами,использующимися в тканях мозга.

Альтернативное полиаденилирование- это сложный процесс, регуляция которого еще до конца не ясна. Сейчас многие лаборатории занимаются исследованиями альтернативного полиаденилирования мРНК, синтезированного с различных генов, например, NO-синтазы (фермент, синтезирующий оксид азота- вещество, синтезирующееся в сосудах и вызывающее их расширение), циклооксигеназы (ключевой фермент в метаболизме арахидоновой ксилоты, с помощью которого синтезируются медиаторы воспаления) и многих других.
Эти исследования необходмы, но кроме того необходимо:

1) исследовать регуляторные последовательности

2) исследовать факторы, участвующие в полиаденилировании

3) систематизировать изучения полиаденилирования мРНК, синтезированных с различными генами

4) исследовать роль альтернативного полиаденилирования в канцерогенезе

5) исследовать роль альтернативного полиаденилирования в процессе старения
Как и любое явление регуляции экспрессии генов, альтернативное полиаденилирование может участвовать в возникновении различных заболеваний, в том числе и возраст-зависимых. К сожалению этот вопрос еще мало изучен и требует тщательной проработки.

30 сентября 2008 года